實驗材料 酵母菌
實驗步驟
1. 用含LEU 2作為選擇標志的酵母菌DNA文庫轉化lea 2 cdc 101-1酵母菌株，在23℃培養，依據插入片段的大小，篩選2 000~20 000個Leu+轉化體。
2.
影印平板轉化體，將其轉印到預熱的選擇性平板，并于37℃培養篩選互補溫感突變的表型。過夜培養之后，含插入互補cdc
101-1突變基因片段的質粒的菌落以及含隨機非互補質粒的潛在CDC 101+回復突變體均可能生長。
重新將平板上出現的每個單菌落劃線并保存作進一步分析。
3. 用酵母菌候選株取得失去質粒的Leu- 菌株，觀察它們在 37℃生長的能力，保留那些能含有質粒時才能在37℃生長的轉化子。
4. 從步驟3中確認的轉化酵母菌中提取總DNA，分別轉化大腸桿菌，從而分離出質粒DNA。重新將質粒DNA轉化到突變的酵母菌株中，并證實已分離到正確的質粒。
5. 通過限制性酶切圖譜對質粒進行分析，確定出現在不同的質粒中的基因組DNA插入片段是否重疊。這種分析可能有助于確定該互補區的邊界。構建不同的插入和缺失突變，檢査它們在酵母菌突變株中互補突變的能力。這將為所克隆的插入片段之內部的基因定位提供更精確的信息。
6. 將一個酵母選擇性標志引入互補區中央的某一位點（基于步驟5獲得的信息）。
7. 將被破壞的質粒再轉化到原突變菌株中，并篩選突變表型，檢查互補作用是否被徹底破壞。構建含一個野生型基因拷貝和一個被破壞基因拷貝的二倍體菌株。
8. 在孢子形成和剖分后，與含被破壞基因拷貝的單倍體孢子產物（通常靠步驟6引入的選擇性標志來找出）與一個含原突變的菌株雜交，如果這個二倍體與原突變株表型相同，說明不存在互補作用，表明與突變相關的基因已被克隆，同時作一個對照實驗，將含破壞基因的單倍體（也許它本身也可能表現非野生型表型）與一野生型孢子雜交，去說明這個二倍體表型是野生型的（表明破壞是一 種隱性突變）。