一、樣品制備
①蛤蜊、牡蠣、貽貝和扇貝 用清水將貝殼外表徹底洗干凈,切斷閉殼肌,開殼,用清水沖洗內部除掉泥砂和其他外來物。將閉殼肌和連接在膠合部的組織分開,仔細取出貝肉,不要割破肉體。開殼前不要加熱或用麻醉劑。收集200g 肉置于10號篩子中瀝水5min(不要使肉堆積),揀出碎殼等雜物,將貝肉均質。
②貝類罐頭 將罐內所有內容物(肉及液體)倒入均質器充分均質。如果是大罐,將貝肉瀝水并收集瀝下的液體,分別稱重,將固形物和湯汁按比例混合,充分均質。
③用酸保存的貝肉 瀝去酸液,分別存放貝肉及酸液,將瀝干的貝肉充分均質。
④冷凍貝類 在室溫下,使冷凍的樣品(帶殼或脫殼的)呈半冷凍狀態,按①方法開殼、清洗、取肉、均質。
⑤貝肉干制品 干制品可 HCl(0.18mol/L)溶液中浸泡(冷藏),按③方法瀝干、均質。
⑥試樣保存 上述經均質處理的樣品如不能及時檢測,可取100g 已均質貝肉加入100mL HCI(0.18mol/L)溶液,置于4℃冷藏保存(盡可能及時檢驗)。
二、測定方法
①方法提要 本方法采用鼠單位測定,對麻痹型貝類毒素(PSP)予以定量。鼠單位定義為:對體重為20g 的小白鼠腹腔注射1mL 貝類提取液后,在15min 時殺死小鼠所需的最低毒素量。采用 saxitoxin 作為毒素的標準品,將鼠單位換算成毒素的微克數。根據小鼠注射貝類提取液后的死亡時間,查出鼠單位,并按小鼠體重,校正鼠單位,計算確定每100g貝肉內的 PSP 的微克數。所測定結果代表存在于貝肉內各種化學結構的 PSP 毒素的總量。
②試劑和材料
鹽酸溶液:0.18mol/L,將15mL 濃 HCl 用蒸餾水稀釋至1L。
鹽酸溶液:5 mol/L,將41.7mL 濃 HCl 用蒸餾水稀釋至100mL。
氫氧化鈉溶液:0.1mol/L,將4.6g NaOH 溶于1L 蒸餾水中。
麻痹性貝類毒素(saxitoxin)標準液:10μg/mL,經酸化,含有20%的乙醇作為保護劑,冷藏時,無限期穩定。
體重19～21g ICR 品系的雄性健康小白鼠。
③儀器和設備 均質器、天平(感量0.5g)、離心機、pH計、秒表、燒杯、量筒、容量瓶、攪棒、注射器(1mL)。
三、測定步驟
①PSP標準工作液的配制 用移液管取1mL(100μg saxitoxin/mL)標準液于100mL 容量瓶中,加入用 HCl 酸化至 pH 值為3的蒸餾水并定容。該液為1μg saxitoxin/mL。pH 值在2.0～4.0之間。在3～4℃下能穩定數周。分別用10mL,15mL,20mL,25mL 和30mL水稀釋10mL 濃度為1μg/mL 標準液,稀釋液的 pH 值應為2～4。
②中位數死亡時間的標準液選擇 將系列濃度的 PSP 標準工作稀釋液各1mL 腹腔注射數只小鼠,選擇中位數死亡時間為5～7min 的濃度劑量。如某濃度稀釋液已達到要求,還需以1mL水的增減量補充稀釋試驗。例如,用25mL 水稀釋的10mL 標準液在5～7min 殺死小鼠,還需要進行24+10和26+10的稀釋度試驗。
以10個小鼠為一組,用中位數死亡時間在5～7min 范圍內的兩種(最好是三種)稀釋度的標準液注射小鼠。記錄每只小鼠腹腔注射完畢至停止呼吸的所需死亡時間。
每只小鼠事先稱重,精確到0.5g 記錄注射完畢至死亡時間的最短間隔為5s,即7s 校正為5s,8s 校正為10s,見下表。
麻痹型貝類毒素死亡時間-鼠單位的關系
時間 | 鼠單位 | 時間 | 鼠單位 | 時間 | 鼠單位 | 時間 | 鼠單位 | 時間 | 鼠單位 |
1:00 | 100 | 2:45 | 4.26 | 4:20 | 2.26 | 6:30 | 1.48 | 12:00 | 1.05 |
1:10 | 66.2 | 2:50 | 4.06 | 4:25 | 2.21 | 6:45 | 1.43 | 12:13 | 1.03 |
1:15 | 38.3 | 2:55 | 3.88 | 4:30 | 2.16 | 7:00 | 1.39 | 12:14 | 1.015 |
1:20 | 26.4 | 3:00 | 3.70 | 4:35 | 2.12 | 7:15 | 1.35 | 12:15 | 1.000 |
1:25 | 20.7 | 3:10 | 3.57 | 4:40 | 2.08 | 7:30 | 1.31 | 12:16 | 0.99 |
1:30 | 16.5 | 3:15 | 3.43 | 4:45 | 2.04 | 7:45 | 1.28 | 12:17 | 0.98 |
1:35 | 13.9 | 3:20 | 3.31 | 4:50 | 2.00 | 8:00 | 1.25 | 12:18 | 0.972 |
1:40 | 11.9 | 3:25 | 3.19 | 4:55 | 1.96 | 8:15 | 1.22 | 12:19 | 0.965 |
1:45 | 10.4 | 3:30 | 3.08 | 5:00 | 1.92 | 8:45 | 1.18 | 12:20 | 0.96 |
③毒素轉換系數的計算 計算用各種稀釋液所注射的10只小鼠的中位數死亡時間。若某種稀釋液注射的所有10只小鼠中位數死亡時間小于5min 或大于7min,則棄去該組結果;若另一種稀釋液注射的10只小鼠中位數死亡時間在5～7min,即使某些小鼠死亡時間可能小于5min 或大于7min,也要使用該組所有數據。但是某組稀釋液經注射后,10只小鼠中有3只以上存活,則要再取10只小鼠進行重復試驗。
根據所選稀釋液注射的10只小鼠中位數死亡時間為5～7min 之間的死亡時間,由上表分別查出鼠單位(MU),再通過資料查出小鼠的體重校正因子,兩者相乘求得每毫升稀釋液的校正鼠單位(CMU)。將所選稀釋液每毫升實際毒素含量的微克數(以石房蛤毒素 saxitoxin 計算)除以 CMU 值便得到毒素轉換系數(CF),即CF=μgSAX/CMU。
計算每組10只小鼠的平均 CF 值,再取其組間平均 CF 值,并以此為標準作常規檢測。
④CF 值定期檢查 如 PSP 檢測間隔時間較長,每次測定時要用適當的標準稀釋液注射5只小鼠,重新測定 CF 值。如果一周有幾次檢測,則用中位數死亡時間5～7min 的標準稀釋液每周檢查一次。測得的CF值應在原測定CF平均值的土20%范圍內。若結果不符用同樣的標準稀釋液另注射5只小鼠,綜合先前注射的5只小鼠結果,算出 CF 值。并用同樣的標準稀釋液注射第二組10只小鼠將第二組求出的 CF 值和第一組的 CF 值進行平均,即為一個新的 CF 值。
重復檢查的 CF 值通常在原結果的±20%之內。若經常發現有較大偏差,在進行常規檢測前應調查該方法中是否存在未控制或未意識到的可變因素。
⑤樣品中 PSP 的提取 取100g 已均質的樣品置于稱重過的800mL 燒杯中,加100mL HCl溶液(0.18mol/L)或樣品中瀝得的酸液,充分攪拌,檢查pH值,pH值應為2.0～4.0。若需要,可逐滴加入HCl(5mol/)或 NaOH(0.1mol/L)攪拌以防止局部堿化使毒素破壞。將混合物加熱,并徐徐煮沸5min,冷卻至室溫,調節已冷卻混合物的pH值至2.0～4.0。將混合物移至量筒中并稀釋至200mL。
將混合物倒回燒杯,攪拌至均質狀,使其沉降至上清液呈半透明狀,直至潷析分離時不產生大至堵塞注射針頭的固體顆粒為止。必要時將混合物或上清液以3000r/min 離心5min,或通過濾紙過濾。保留足以進行小鼠注射用的液體。
⑥小鼠試驗 將小鼠稱重并記錄質量。每個樣品注射三只小鼠。對每只試驗小鼠腹腔注射1mL提取液。注射要準確熟練,若有一滴以上提取液溢出就須將該只小鼠丟棄,并重新注射一只小鼠。記錄注射完畢時間仔細觀察小鼠停止呼吸時所表明的死亡時間(到小鼠呼出最后一口氣止),用秒表記錄死亡時間。若小鼠的中位數死亡時間小于5min,則要進行稀釋再注射另一組小鼠3只,以得到5～7min 的死亡時間。若注射未稀釋的樣品后,1或2只小鼠的中位數死亡時間大于7min,則需注射至少3只小鼠以確定樣品的毒力。如需稀釋樣品,要逐滴加入 HCl(0.1或0.01molL),調節稀釋液的pH值至2.0～4.0。
四、結果的計算與判斷
①PSP 毒力的計算與判斷 根據小鼠的死亡時間,在表1中查出相應的每毫升注射液的鼠單位數 MU。若試驗動物質量小于19g 或大于21g,則就根據表2查出質量校正系數,質量校正系數乘以該只小鼠的 MU 便得到 CMU。計算該組小鼠的中位值 CMU(將存活鼠的死亡時間視為大于60min 或相當于小于0.875MU)。以中位值按下列公式計算樣品中的 PSP 毒素的含量。
μgPSP/100g肉=中位數CMU/mL×CF×稀釋系數×200
任何大于80μg/100g肉的值即被認為是有害的,對人類食用不安全。
②MU毒力的計算與判斷 取得麻痹性貝類毒素標準品有困難的實驗室可使用鼠單位MU對檢驗結果予以計算與判斷。按①求出該組小鼠的中位數CMU,然后求出100g貝肉的MU值。
MU/100g 肉=中位數CMU/mL×稀釋系數×200
任何大于400MU/100g 肉的值即被認為是有害的,對人類食用不安全。