高效液相色譜儀的原理

儲液器中的流動相被高壓泵打入檢測系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱（固定相）內，由于樣本溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中作相對運動時，經過反復多次的“吸附-解吸”的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣本濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式輸出檢測結果。

根據分離機制的不同，HPLC原理可分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法及分子排阻色譜法。

1. 液固吸附色譜法

液固吸附色譜法中，固定相為固體吸附劑，根據各組分吸附能力差異而使組分得以分離。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，大多數用于非離子型化合物。吸附色譜固定相可以分為極性和非極性兩大類。對流動相的要求為：

1) 選用的溶劑應當與固定相互不相溶，并能保持色譜柱的穩定性。

2) 選用的溶劑應有高純度，以防所含微量雜質在柱中積累，引起柱性能的改變。

3) 選用的溶劑性能應與所使用的檢測器相匹配，如果使用紫外吸收檢測器，就不能選用在檢測波長下有紫外吸收的溶劑；若使用示差折光檢測器，就不能用梯度洗脫。

4) 選用的溶劑應對樣品有足夠的溶解能力，以提高測定的靈敏度。

5) 選用的溶劑應具有低的黏度和適當低的沸點。

6) 應盡量避免使用具有顯著毒性的溶劑，以保證工作人員的安全。

液固色譜法是以表面吸附性能力為依據的，所以它常用于分離極性不同的化合物，也能分離那些具有相同極性基團，但數量不同的樣品。

2. 液液分配色譜法

固定相為液體，根據被分離的組分在流動相和固定相中的溶解度不同而分離。依固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法和反相色譜法。正相色譜法采用極性固定相，流動相為相對非極性的疏水性溶劑，常用于分離中等極性和極性較強的化合物；反相色譜法一般用非極性固定相，流動相為水或緩沖溶液，適用于分離非極性和極性較弱的化合物。其中，反相色譜應用最廣。

3. 離子交換色譜法

固定相是離子交換樹脂。樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。

4. 分子排阻色譜法

分子排阻色譜法又稱凝膠色譜法，它是按照分子尺寸大小順序進行分離的一種色譜方法。分子排阻色譜法的固定相凝膠是一種多孔性的聚合材料，有一定的形狀和穩定性，利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。根據所用流動相的不同，凝膠色譜法可以分為兩類：即用水溶劑做流動相的凝膠過濾色譜法(GFC)與用有機溶劑如四氫呋喃做流動相的凝膠滲透色譜法(GPC)。