DNA的酶切與連接

標準pUC19（2686bp）

EcoRI及其配套的酶切緩沖液   0.5×TBE電泳緩沖液  6×Loading Buffer  Goldview  瓊脂糖

水平電泳儀  水浴鍋  移液器  微波爐  成像設備

1.在200ul的離心管中，按照下表加入試劑（單位：ul），混勻；點動離心將反應液甩至管底。37℃保溫2h進行酶切反應。


2.反應結束后，加入2ul  10x Loading Buffer鈍化酶活性；（或：65℃，保溫20min使酶失活）。

3.電泳檢測。

酶切陰性對照：pUC19標樣+10x Loading Buffer 2ul

酶切樣品：標準pUC19酶切樣品10ul + 10x Loading Buffer 2ul

4.質粒及酶切樣品電泳預期結果。

影響酶切的因素：在酶切反應中，DNA的純度、緩沖液中的離子強度、Mg²⁺等因素均可影響反應，一般可通過增加酶的用量，延長反應時間等措施以達到完全酶切。但應注意的是，過多的酶量和過長的反應時間會造成非特異性的酶切（星號活性）。

可以采用無縫克隆作為替代方案進行基因重組。