ELISA檢測肺炎支原體抗體IgM

ELISA檢測肺炎支原體抗體IgM

[檢測方法] ELISA
[方法學原理] 將微孔表面包被純化的肺炎支原體抗原，將被稀釋過的患者血清加入微孔中，如存在支原體抗體可與微孔上抗原相結合，然后洗去未結合物質，再加入酶標記抗人IgM與抗原抗體復合物結合，洗去未結合的酶標記抗體，最后加入顯色液。在特定時間終止顯色反應，通過酶標儀校正和對照相比讀出結果。
[標本準備] 取新鮮末梢血或靜脈血。如采血后24h內不能進行試驗，分離血清后將其保存于一20℃環境中。檢測時，使樣本恢復至室溫。
[試劑]
1．預包被微孔板
2．陽性對照
3．弱陽性對照
4．陰性對照
5．標本稀釋液
6．濃縮酶聯物
7．底物A、B
8．終止液
[儀器] 酶標儀或全自動酶聯免疫檢測儀。
[檢測步驟]
1．配制洗滌液 1瓶濃縮洗滌液加475ml蒸餾水。配好的洗滌液短期內可置室溫環境，長期可存于2—8℃環境中。
2．配制酶聯物 按1：101倍稀釋，即取10tzl濃縮酶聯物加酶聯物稀釋液l 000ul(根據檢測標本數量確定稀釋量)，未用完的丟棄。
3．待試劑盒平衡至室溫后，待測標本用按1：51稀釋，取4ul血清與200u1標本稀釋液混合。
4．將稀釋標本置37℃環境中20min。
5．各加100ul陽性、弱陽性、陰性對照及已稀釋待測標本上清液于相應孔中，空白對照孔加100ul標本稀釋液，蓋好反應板，37℃環境中孵育30min。
6．甩盡板中液體，每孔用200—300ul洗滌液洗5次，每次均需拍干。
7．每孔加酶聯物100t~l，蓋好反應板，37℃環境中30min。
8．甩盡板中液體，洗5次，每次拍干。
9．加底物A、B各1滴或各50P1，混勻，37℃環境中15min。
10．取出，加終止液1滴，用酶標儀450nm測其OD值。若肉眼觀察，不加終止液判斷結果。
[結果判斷]
1．陰性對照平均OD值須小于0．20。
2．弱陽性對照平均OD值須在0．20～0．65。
3．弱陽性對照和陰性對照的平均OD值之比須≥2。符合以上3種條件時，本試驗結果可信，否則重復試驗。
4．若待測標本孔顯色比弱陽性對照孔深則判為陽性，反之為陰性。但在弱陽性對照值上下10％范圍內最好再測1次，如確實高于弱陽性對照則可判為陽性。
[注意事項]
1．本試驗結果須結合臨床表現、病史作出診斷，方可采取適當臨床處理。
2．試劑盒內雖然含有消除干擾因子的物質，但仍可能會有少量標本難以除盡干擾。因此，如果某標本幾項IgM均為陽性，應考慮有RF的干擾。
[臨床意義] IgM抗體是早期抗體，于起病第1周末出現，用于早期診斷；IgG抗體是恢復期抗體，于起病2—3周后出現，動態觀察可用于確定診斷。