FCM對外周白細胞的免疫熒光分析（一）

外周血是臨床檢驗中的重要標本。FCM分析外周白細胞的主要目的是了解各種白細胞的數目與分群情況。這些數字的變化與臨床的某些疾病有一定的關系。近年來，由于多種識別白細胞膜表面抗原的單克隆抗體的發現，以及對這些單克隆抗體的直接或間接熒光標記物的出現，使得利用FCM的熒光組織化學分析獲得被測細胞的多指標的更多、更準確的信息，這無疑對警覺臨床和科研有很大幫助。本節　主要討論有關外周血的白細胞的免疫熒光標記技術、數據分析及臨床應用等方面的問題。

一、白細胞的免疫熒光標記技術

1．白細胞抗原下面給出世界衛生組織對白細胞抗原的統一命名，以及它們的分子量、對應的單克隆抗體及反應陽性的細胞（見表10-2）。

表10-2　WHO對白細胞分化抗原的命名

a：急性淋巴細胞性白血病；b：慢性淋巴細胞性白血病。

2．樣品的制備供FCM分析的樣品是單細胞懸液，而且大部分樣品都需經熒光染色。樣品的制備方法大致有三種：①用熒光單克隆抗體染全血，隨后溶解紅細胞；②紅細胞溶解后染色；③通過梯度離心法分離出單個淋巴細胞和單核細胞，再將之制成細胞懸液染色。

（1）全血染色后溶解紅細胞：由于不少血液標本具有生物危害性，用此方法可以將染色、溶解、固定、分析幾個步驟都在一個試管內進行，這樣減少轉換過程中的污染。而且此法比用梯度離心分離出單個核細胞更節　省時間。由于此法未將粒細胞去除，故在用FCM分析時，要注意排除粒細胞的干擾。

具體操作步驟如下：

①全血100～150μl，放入5ml試管，并用50～100μl PBS稀釋，總體積為200μl。]

②熒光標記的單克隆抗體染色30min，4 ℃ （或放于冰上）。單克隆抗體的濃度因不同來源差異很大，但為了使用方便，可按其說明書配成每次實驗使用10μl。注意蔽光。

③用3～4μl冷BPS清洗。離心250×g（約每分鐘1500轉），5min，洗3次。注意每次用吸管將上清吸出，決不能傾倒去液！

④用2ml氯化銨液（配法見下）在室溫下溶解紅血球，約10min。若紅細胞完全被溶解，溶液由混濁變到透明。注意溶解程度的掌握十分重要：若溶解過分，則導致白細胞上抗原被破壞，或者某些敏感的細胞死亡而導致比例的改變。若溶解不徹底，大量紅細胞會影響對淋巴細胞的分析。這是因為淋巴細胞在分析圖像上與紅細胞群接近，在框出淋巴細胞群時，會把部分紅細胞框定于淋巴細胞內。而紅細胞溶解不足或過度在很大程度上影響著分析結果。

【氯化銨液的配制】

　　Tris—氯化銨1×氯化銨

　　0.16mol/L 　NH 4 Cl 　　0.38g/100ml　 　90ml 　　0.16mol/L　　NH 4 Cl

　　0.17mol/L 　Tris 　　2.06g/100ml 　　10ml　　0.17mol/l 　　Tris

　　pH值7.56 　　　　　　　　　　　　　　　　pH值7.2

⑤紅細胞被徹底溶解，加入1ml PBS稀釋的0.5%甲醛，立即離心，洗3次，條件同步驟③。加入甲醛的目的是盡早固定細胞和細胞上的抗原，避免有生物危害的標本到處污染。

⑥將染色完成的細胞懸浮于0.5～1ml的0.1%甲醛溶液內。置4 ℃ ，蔽光，等待分析。經固定后的細胞在冰箱內可保存一周，這樣對工作的安排會帶來方便。