FDDPCR實驗

cDNA 礦物油

熱循環儀 薄壁 PCR 管

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

礦物油（可選）

2. 核酸和寡核苷酸

來自方案 3 的 cDNA

3. 專用設備

熱循環儀 [推薦使用 GeneAmpPCRSystem9600(Perkin-Elmer)，或者 Mastercyder(EppendorfScientific)]

0.2 ml 薄壁 PCR 管

4. 附加試劑

RNAspectraFluorescentmRNA 差異顯示系統（GenHunterF501~F510&R501-R510)，包括蒸餾水、10XPCR 緩沖液（100mmol/LTris-HCl、pH8.4，500 mmol/LKC1，15 mmol/LMgCl₂,0.01% 明膠）、FDDdNTP 混合液（2.5 mmol/L)、熒光錨定引物（FH-TUM)(2umol/L) 以及任意引物（H-AP)(2umol/L)

二、方法

1. 在不同的 1.5 ml 離心管中，為每個 FH-TUM 錨定引物單獨配制一個 FDD-PCR 主體混合液。

蒸餾水                                                                 91.8ul

10XPCR 緩沖液                                                   18.0ul

FDDdNTP 混合液                                                 14.4ul

FH-T11M 引物（M=G、A 或 C)                            18.0ul

Taq DNA 聚合酶（Qiagen201207Valencia，CA) 1.8ul

2. 將熱循環儀的程序設置為：94°C15s→40°C2 min→72°C60s→40 個循環→4°C 平衡。
如果使用的不是推薦的熱循環儀，那么將變性（94°C)'時間調整為 30s。

3. 各取 16ul 相應的 FDD-PCR 主體混合液，加到標記好的 0.2 ml 薄壁 PCR 管中。例如，將 8 個管子標記為錨定引物 FH-T₁₁ G 與任意引物 H-AP1~8 的組合，同樣標記好所有的 24 個引物組合，包括 FH-T11A 與 H-AP1~8 和 FH-T11C 與 H-AP1~8。

4. 在每個 0.2 mlPCR 管中，加入 2.0ul 相應的 cDNA(來自方案 3 的 RT 反應）。

5. 在每個 0.2 mlPCR 管中，加入 2.0ul 相應的 H-AP, 混勻，總反應體積為 20ul。如果需要，加入 25ul 礦物油。

6. 將 0.2 mlPCR 管放到熱循環儀中，開始運行程序（見第 2 步）。完成后，反應產物在黑暗中-20°C 保存。