Fe（II）EDTA保護測定法實驗

RNA洗脫緩沖液 退火緩沖液 硫脲 抗壞血酸鈉

水浴 垂直電泳裝置 暗片盒

一、材料與設備

1. 水浴。

2. 垂直電泳裝置。

3. 暗片盒。

4. RNA 洗脫緩沖液：80% 甲酰胺，40 mmol/L PIPES，1 mmol/L EDTA，0.4 mol/L NaCL。

5. 退火緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5 )，50 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl₂。

6. (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ 溶液：10 mmol/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ ( Sigma 公司），20 mmol/L EDTA，用前搖勻。

7. 100 mmol/L 硫脲。

8. 0.9% H₂O₂。

9. 10 mmoI/L 抗壞血酸鈉。

二、操作方法

1. 制備 RNA：通過 PAGE 純化末端標記的 RNA，用 RNA 洗脫緩沖液抽提含有 RNA 的凝膠條塊，再用乙醇沉淀 RNA。

2. 退火：以使 RNA 形成適當的結構。用 50 μl 的退火緩沖液將 RNA 濃度調整為 25 mmol/L，95℃ 加熱 2 min后，置于冰上 1 h。

3. 反應：將 7 μl 的 RNA、1 μl 10 mmol/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ 溶液，1 μl 10 mmol/L 抗壞血酸鈉和 0.9% 的 H₂O₂ 混合，于 20°C 溫育 10 min 后加入 1 μl 100 mmol/L 硫脲以終止自由基反應。

4. 檢測：用含 8 mol/L 尿素的 10%~15% PAGE 和放射自顯影對切割產物進行分析。