1、檢樣稀釋：以無菌操作，將檢樣 25 g(或 25 mL)剪碎放于含有225 mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(內置適量玻璃珠)或滅菌乳缽內，經充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體樣品在加入稀釋液后，最好置均質器中以8 000 r/min～10 000 r/min的速度處理1min，做成1:10的均勻稀釋液。根據國家或當地衛生標準要求及對樣品污染程度的估計，連續做幾個10倍遞增稀釋，并選擇3個連續的稀釋度，用于接種乳糖膽鹽發酵管。
2、乳糖發酵試驗：接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發酵管；1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發酵管。選擇3個稀釋度，每個稀釋度接種3管乳糖膽鹽發酵管，置于36±1℃ 培養48±2h，觀察是否產氣。不產氣的管報告為大腸菌群陰性。
3、分離培養：將產氣發酵管培養物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，36±1℃培養18～24h，觀察菌落形態。
典型的大腸菌群菌落呈紫黑色并帶有金屬光澤或無光澤，而紅色、粉紅色菌落檢出率較低。
4、證實試驗：挑取平板上的可疑菌落，進行革蘭氏染色鏡檢。同時接種乳糖發酵管36±1℃培養24±2h，觀察產氣情況。凡乳糖發酵管產氣、鏡檢為革蘭氏染色陰性的無芽孢桿菌者，即可報告為大腸菌群陽性。
5、報告：根據證實為大腸菌群陽性的管數，查MPN表，報告每100ml(g)大腸菌群的MPN值。根據試驗的陽性管數計算出樣品中大腸菌群的含量，報告出每100mL(g)大腸菌群的最可能數。
具體操作參見GB4789.3-2010《中華人民共和國國家標準食品衛生微生物學檢驗 大腸菌群測定》。