NHS 酯是通過羧酸鹽分子的碳二亞胺活化形成的反應基團（參閱碳二亞胺交聯劑化學）。NHS 酯活化的交聯劑和標記化合物在生理至弱堿性條件下（pH 7.2 至 9）與伯胺反應，形成穩定的酰胺鍵。反應釋放出 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）。
化學偶聯伯胺的 NHS 酯反應方案。R 代表具有 NHS 酯活性基團的標記試劑或交聯劑的一端；P 代表含有靶官能基團（即伯胺）的蛋白質或其他分子。
NHS 酯水解與伯胺反應產生競爭。水解速率隨緩沖液 pH 值的增加而增加，低濃度蛋白質溶液中的交聯效率降低。在 pH 7.0 和 0°C 下，NHS-酯化合物的水解半衰期為 4 至 5 小時。在 pH 8.6 和 4°C 下，該半衰期降低至 10 分鐘。在不含伯胺的水溶液中，NHS 酯水解的程度可以在 260 至 280 nm 處測量，因為 NHS 副產物在該范圍內吸收峰。
NHS-酯交聯反應最常在室溫或 4°C 下于 pH 7.2-8.5 的磷酸鹽、碳酸鹽-碳酸氫鹽、HEPES 或硼酸鹽緩沖液中進行（0.5-4 小時）。與伯胺緩沖液（例如 Tris，TBS）不相容，因為它們會發生競爭反應。但是，在某些步驟中，結合步驟結束時可添加 Tris 或甘氨酸緩沖液以淬滅（停止）反應。
低濃度疊氮化鈉（≤3 mM 或 0.02％）或硫柳汞（≤0.02 mM 或 0.01％）通常不會明顯干擾 NHS-酯反應，但濃度較高時會產生干擾。不純的甘油和高濃度甘油（20-50％）也會降低反應效率。
Sulfo(磺基)-NHS 酯除了在 N-羥基琥珀酰亞胺環上含有磺酸根（–SO3）外，其他部分與 NHS 酯相同。該帶電基團對整個化學反應沒有影響，主要用于增加含有它們的交聯劑的水溶性。此外，帶電基團可防止Sulfo-NHS 交聯劑穿過細胞膜，使它們可用于細胞表面交聯。
Sulfo-NHS 酯反應方案用于與伯胺發生化學結合。R 代表具有Sulfo-NHS 酯反應性基團的標記試劑或交聯劑一端；P 代表含有靶官能基團（即伯胺，–NH2）的蛋白質或其他分子。
NHS-酯試劑的溶解度隨緩沖液組成和分子結構其余部分（例如，間隔臂）的物理性質發生變化。許多非磺化 NHS-酯試劑是非水溶性的，必須首先溶解在可與水混溶的有機溶劑中（例如 DMSO 和 DMF）才能添加至水性反應混合物中。因此，與非水溶性NHS-酯發生交聯反應通常需要在水性反應中加入 0.5-10％ 的有機溶劑。
NHS 與Sulfo-NHS 交聯劑的對比。DSS 和 BS3（磺基-DSS）的化學結構。DSS 不能直接溶于水，一旦溶解便會穿過整個細胞膜，在細胞內部發生交聯。BS3 是水溶性的（在常規工作濃度下），帶電后不能穿細胞膜內，而將 BS3 交聯局限在完整細胞表面上。