問題和解答

1. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時預電泳是怎么回事的？預電泳時要加6×DNA上樣緩沖液嗎？電泳1－2小時再加結合反應產物嗎？

預電泳是除去凝膠中沒有聚合的單體和雙體和聚合引發劑，提高分辨率，不加任何物質，一般３０－６０分鐘后加樣電泳。

2. 銀染的步驟是什么？銀染的關鍵因素是什么？

步驟是：

（1） 固定：10%冰乙酸min。

（2） 清洗：雙蒸水沖洗凝膠次，每次1min。

（3） 染色：染色液（1g硝酸銀，.5mL37%甲醛，1L雙蒸水。現配）染色30min。

（4） 清洗：迅速洗凝膠次。

（5） 顯影：30g碳酸鈉，1.5mL37%甲醛，200uL 10mg/L硫代硫酸鈉。顯影至清晰帶紋出現。

成功銀染的關鍵因素包括：

（6） 用超純水（比如，NANOpure或Milli-Q純化）或者是雙蒸水作銀染。

（7） 用提供的碳酸鈉或者ACS試劑級的碳酸鈉。

（8） 在染色后，水清洗所用時間的長短很重要，用不超過5-10秒的時間清洗膠，然后放入顯色溶液中，一般在水里浸一下就好。

（9） 甲醛和硫代硫酸鈉（ul/1ml）在使用前，及時加入到顯色液中。

（10） 在使用前及時配染色液。

3. 變性PAGE的上樣緩沖液配方？如何準備上樣的蛋白？是將細胞用超聲破碎,還是用細胞裂解液,大多細胞裂解液中均含有SDS,不知有沒有用于非變性

PAGE 的裂解液.具有操作步驟是什么?

非變性的PAGE buffer就是0.5xTBE,上樣緩沖液可以用普通的loading buffer，含有Tris,溴芬蘭以及甘油即可，甘油是主要的沉淀作用成分。都可以自己

配。細胞超聲即可，超聲后離心取上清.也有配NATIVE-PAGE gel所用buffer為1*TBE,用的running buffer也是1*TBE。還有一點就是要在配gel時考慮能使蛋

白多聚體穩定的因素。

4. 做了naive---PAGE沒有條帶，蛋白質是純品，分子量很大，怎么回事呢？

因為分子量很大，8%的膠濃度較合適。加樣時加個marker，可以檢測膠制備是否有問題。銀染方法比較靈敏，如果蛋白是一種酶，且可使某種底物顯色的話，可以用活性染色試試，更靈敏。

Native-PAGE注意幾個問題
1. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的過程中，蛋白質的遷移率不僅和蛋白質的等電點有關，還和蛋白質的分子量以及分子形狀有關，其中蛋白質的等電點是最重要
的影響因子，要根據蛋白質的等電點來選擇對應的電泳緩沖系統；
2. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的過程中，要注意電壓過高引起發熱而導致蛋白質變性，所以最好在電泳槽外面放置冰塊以降低溫度；
3. 蛋白質的分子量較大，則電泳時間可以適當延長，以使目的蛋白質有足夠的遷移率和其它的蛋白質分開，反之亦然;
4. 變性樣品的離子強度不能太高（I<0.1mM）。調整樣品的PH在4.0左右，這對于能否做好非變性樣品非常重要。上樣BUFFER 中沒有SDS之外，加入樣品后不能加熱.