OsAGAPmRNA原位雜交

發布時間：2019-04-20 10:04 原文鏈接： OsAGAPmRNA原位雜交

實驗概要

本實驗以OsAGAP mRNA為試材介紹了原位雜交技術，包括：原位雜交正義、反義探針制備，原位雜交探針半定量，植物材料的固定與石蠟包埋，切片與粘片，雜交和顯色等過程。

實驗步驟

1. OsAGAP原位雜交正義、反義探針制備

對OsAGAP cDNA全長在GenBank中做BLAST分析，選取特異性最強的片段(767bp-987bp)用于探針制備，據此設計5’端引物：5’-CTC TCA AAC TGC AAGCGT-3'；3’端引物：5’-CAG CTC CTG CCT CAC CT-3'。將利用這對引物擴增到的OsAGAP(767bp-987bp)片段，分別以正向和反向連接到T easy載體上，用于探針制備。

利用DIG T7/SP6 Labeling kit ( Roche)來完成正義和反義探針的的高辛標記，反應程序依據其用戶手冊。正義、反義探針分別采用T7、SP6 RNA polymerase進行標記。取線性化的質粒模板1ug，加入DEPC處理的雙蒸水至13ul；管中加入：

10 X NTP labeling mixture 2ul；

10 X Transcription buffer 2ul；

RNase inhibitor 1ul；

T7/SP6 RNA polymerase 2ul。

輕柔混勻后，37℃，溫育2hr；加入2ulRNase-free的DNase15min，去除DNA模板；37℃，溫育電泳確定探針標好及模板去除后，加入2ul0.2M的EDTA ( pH8.0 )終止反應；加入2.5ul4M LiCI，lul l0mg/ml tRNA和75ul無水乙醇，混合后，-20℃沉淀過夜；4℃，13000rpm離心10min，去上清；沉淀用70%乙醇洗2次；超凈臺吹干，溶于100ulDEPC處理的ddH₂O中，55℃溫育l0min，分裝、存于-70℃備用。

2. 原位雜交探針半定量

反應試劑采用DIG Northern Blot Kit ( Roche )，反應程序參照試劑盒說明書。取試劑盒提供的Dig labeling RNA標準品做梯度稀釋，濃度依次為：10pg/ul，30pg/ul，100pg/ul，lng/ul，l0ng/ul。取標記好的OsAGAP( )和OsAGAP(一)探針分別以如下比例稀釋：1/4，1/16，1/64，1/256，1/1024。將以上梯度稀釋的Dig labeling RNA標準品、OsAGAP( )、OsAGAP(一)溶液，各取1ul點在2x3厘米的帶正電荷的尼龍膜(Bio-Rad)上，超凈臺吹干，120℃，烘烤30分鐘以將RNA固定在尼龍膜上。

將膜在Malefic acid buffer中室溫平衡2min；倒出液體，加入1 X blockingsolution室溫輕搖30min；換上Antibody ( Roche ) solution ( Anti-DIG-Ap：1Xblocking solution=1:10000)，在室溫中放置30-120min；倒出液體，用Washingbuffe：漂洗2 X 15min；倒出液體，加入TNM50室溫平衡3min；倒出液體，加入顯色液BCIP/NBT:稀釋液=1:50(華美公司)，暗中顯色，顯色結束，用蒸餾水漂洗尼龍膜終止反應。根據Dig labeling RNA標品的顯色強度為標準，分別計算正、反義探針濃度，備用。

3. 植物材料的固定與石蠟包埋

植物取材時，用到的鑷子、剪刀都是先用酒精燈灼燒，盡量保證不受RNase污染。用RNase free的FAA固定液中固定，真空抽氣至材料沉底，室溫放置過夜；經50%，70%，90%，100%，100%，100%，100%乙醇處理逐級脫水，每步30min；25%二甲苯-75%乙醇、50%二甲苯-50%乙醇、75%二甲苯-25%乙醇、90%二甲苯-10%氯仿、90%二甲苯-10%氯仿、90%二甲苯-10%氯仿透明材料，每步30min；50%二甲苯-50%石蠟(Sigma)中，42℃，4-16hr；重復一次；將材料移入60℃溫箱，更換為純石蠟浸蠟；60℃保溫，每12小時更換石蠟一次，期間更換4次純石蠟；包埋蠟塊，4℃保存。

4. 切片與粘片

將材料切成6um厚的蠟帶(幼穗除外，16um)，顯微鏡下鏡檢，挑選合適部位的蠟帶，小心地將蠟帶放在置于42℃展片臺上的涂有多聚賴氨酸化載玻片(Sigma)的水面上，至蠟帶平整熨貼；吸掉載玻片上的水，42℃溫箱中粘片48hr以上備用。

5. 雜交和顯色

貼好材料的片子經過100%二甲苯2 X 20min、以及2/3二甲苯-1/3乙醇、1/3二甲苯-2/3乙醇、100%，100%，90%，70%，50%，30%，10%乙醇、ddH₂O，ddH₂O脫蠟、復水，每步2min；然后，轉入37℃預熱的、含1-5ug/ml蛋白酶K (Roche)的蛋白酶K buffer中，37℃處理30min；用滅活的DEPC-ddH₂O洗滌3次；將片子放入剛剛混合好的乙酰化溶液中，5min；再用2 X SSC處理兩次，每次5min，；經10%，30%，50%，70%，90%，100%，100%乙醇梯度處理，每步2min；片子42℃晾干，每張載玻片上加75ul雜交液，用parafilm膜輕輕覆蓋，在濕室中，42℃雜交過夜；

4X SSC漂洗4次，每次5-l0min；轉入37℃預熱的，含25ug/ml RNase A(Sigma)的RNase buffer中，37℃處理30min；再經RNase buffer 37℃漂洗3次，每次15min； 800m12 X SSC漂洗2次，每次30min；800ml 0.1 X SSC漂洗30min；轉入1 X PBT，平衡5min；l/20 X Blocking solution(用1 X PBT稀釋)封閉30-60min；1 X PBT，平衡1 min；加入Antibody ( Roche ) solution，在濕室中放置30-120min；250ml 1 X PBT，漂洗2次，每次20min；換成TNM50室溫平衡5min；在載玻片上加顯色液(BCIP:NBT:稀釋液==1:1:50)，暗中顯色；顯色合適后，置于TEbuffer中終止顯色反應。

如前所述梯度脫水；然后依次1/3二甲苯-2/3乙醇、2/3二甲苯-1/3乙醇，100%二甲苯、100%二甲苯每步1-2min透明；封片。

注意事項

雜交前和雜交過程中所有物品設備應防止RNsae污染。