PCR(多聚酶鏈反應)

【實驗目的】

掌握PCR技術的原理，學習PCR技術的基本方法，了解PCR技術的應用范圍與意義。

【實驗原理】

詳見14章第2節。

【實驗對象】

特定的DNA序列。

【試劑與器材】

引物(primer)，根據需擴增的DNA設計相應的引物；TagDNA聚合酶； 10×PCR緩沖液(隨酶一起購買)；5mmol/L dNTP貯備液(商品化產品)；DNA模板(需擴增的 DNA)；雙蒸水；礦物油；PCR反應管；微量移液器；離心機及PCR儀。

【實驗方法與步驟】

標準的PCR操作程序是將各種所需反應成分分別加入PCR反應管中，然后根據具體的實驗要求，設置一定的循環參數，進行循環擴增。具體如下：

(1) 向PCR反應管中依次加入

DNA模板 50～300ng (約為102～105拷貝DNA)

引物(3'→5'，5'→3')各 2μl 10μmol/L (終濃度為0.4μmol/L)

dNTP 2μl 5mmol/L (終濃度為0.2μmol/L)

10×PCR緩沖液 5μl 1/10體積 (終濃度為1×)

MgCl2 3μl 25mmol/L (終濃度為1.5mmol/L)

Taq DNA聚合酶 0.5μl (終濃度約1～5U/μl)

ddH2O 補到終體積為50μl，混勻后，離心15 s使反應成分沉于管底。

(2) 加入礦物油20～30μl（2～3滴），以避免反應液蒸發(有熱蓋的PCR儀可省此步驟)，然后將反應管置于95℃（變性）5min。

(3) PCR的循環程序一般為：94℃～96℃變性30s， 50℃～55℃退火30～60s，72℃延伸(1kb/1～2min)，循環25～30次。末次循環結束后，將反應管置于72℃溫育5min，以確保充分延伸。

【實驗結果檢測】

PCR擴增產物的分析法：PCR擴增DNA片段只是一個重要手段，擴增片段的檢測和分析才是目的，根據研究對象和目的的不同而采用不同的分析法。

瓊脂糖凝膠電泳可鑒定擴增產物的大小；點雜交技術除可鑒定擴增產物外，還有助于產物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴增產物中鑒定出特異產物的大小，增加檢測的特異性與敏感性；最近發展的一系列產物分析法(PCR-ELISA、PCR-EIA、PCR-OLA等)均有助于PCR產物的精確分析。

【注意事項】

1. 引物的質量是保證PCR特異性的關鍵，引物過長或過短均會使特異性降低，以18～30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內部和引物之間不應含有互補序列；引物的堿基順序與非擴增區域的同源性應小于70%；

引物的3’末端與模板DNA一定要配對，但末端沒有嚴格的限制，故引物設計時可在5’末端加上限制性內切酶位點和/或啟動密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產物中的不完整序列、脫嘌呤產物、堿基修飾鏈等“雜質”；引物的終濃度一般為0.2～0.5μmol/L，過低會影響反應產量，過高會增加引物二聚或錯配的幾率。

2. Taq DNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但無3’-5’外切酶活性，因此對單核苷酸的錯配無校正功能，發生堿基錯配的幾率為2.1×10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優勢在于反應產量高于其他DNA聚合酶。

Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經基因工程改造后，新創出的Pfu Ultra具有更佳的校驗活力。

數據顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶(保真度＝1/錯誤率) (數據來源：美國冷泉港實驗室)。

3. Mg2+濃度也是影響反應效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結合，不同反應體系中應適當調整MgCl2的濃度，一般以比dNTP總濃度高出0.5～1.0mmol/L為宜，Mg2+過量能增加非特異擴增。

4. dNTP的濃度過高會增加堿基的錯誤摻入率，使反應特異性下降；過低則會導致反應速度下降。使用時4種dNTP必須以等當量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯配誤差和提高使用效率。

5. 溫度循環參數中應特別注意復性溫度，它決定引物與模板的特異性結合。退火復性溫度可根據引物的長度，通過Tm＝4(G+C)+2(A+T) 計算得到。在Tm允許的范圍內，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結合。

6. 減低污染的常規措施：

①將PCR試劑、PCR產物及其他分子生物學試劑分開放置；

②應保持樣品制備、PCR反應液配制與PCR產物分析三個工作區的獨立性；

③使用陽性和陰性對照；

④使用最高質量的水配制PCR實驗的所有反應試劑；

⑤配制好的PCR反應試劑應分成小包裝儲存，每個包裝僅用于單次實驗；

⑥制備樣品、配制試劑及反應液時必須戴手套；

⑦實驗前一定要認真清潔加樣器等。

　思 考 題

1. PCR技術的基本原理是什么?

2. PCR的基本反應條件有哪些?

3. 哪些因素影響PCR產物的特異性?