PCR的優化

PCR的優化
在PCR的優化開始階段，應用新的DNA模板，引物或熱穩定DNA聚合酶等材料建立的PCR方法，其擴增效果一般總不是最佳的。這種PCR反應通常要求盡量抑制非特異性擴增和（或）增加目的DNA產物的產率。表1列舉了一些通常遇到的問題和對PCR反應進行優化的一些推薦方法。
表1 PCR擴增的疑難解析
問題  解釋  補救措施
目的產物條帶在兩種陽性對照管與試驗管內部呈現明顯的非常模糊的帶型。目的產物條帶有時呈不清晰的成片條帶，條帶在凝膠中擴散到較期望分子量更小的DNA分子量的區域內。  無效引導或無效延伸  通過建立兩個引物不同濃度的PCR系列試驗，從中發現兩個引物的最適濃度；通過建立降落PCR系列試驗，摸索最佳鎂離子濃度的水平。
應用GC-Melt（Clonte-CH）PCR反應混合液。
應用盡可能低的復性溫度（即退火溫度）考慮添加佐劑，如在反應體系中加牛白蛋白（0.2~0.6mg/ml），二甲基亞砜（5%）或甘油（5%）
目的產物條帶在陽性對照管2與試驗管內呈現非常模糊的帶型，而在陽性對照管1內卻又很強的條帶。  模板DNA不純。  重新純化模板DNA，用酚：氯仿抽提兩次，乙醇沉淀回收。純化后的DNA樣品溶解于水中（不含EDTA）。
在陰性對照管擴增出目的條帶。  盛模板DNA的塑料器具溶解模板DNA的溶液污染所致。  重新配置新的試劑。
擴增產物呈現明顯的分子質量錯誤的條帶。  根據一條或兩條引物的非特異性引導。  縮短復性時間或增加復性溫度。
擴增目的產物DNA呈現模糊的廣泛的成片條帶。  要么為引物二聚體所致的擴增；要么為模板DNA過量。  檢查引物是否均一及模板DNA序列內是否具有高度重復序列存在。優化每條獨立引物的濃度。
應用降落PCR和（或）熱啟動PCR。降低模板DNA的量。

對可能發生在PCR過程中的主要問題的解析
表2描寫在PCR擴增反應中可能遇到的一些問題以及提供怎樣解決這些問題的一些方法。
表2 多種PCR擴增過程的一些疑難問題的診斷與解決方法
癥狀  可能原因  補救措施
擴增的目的產物條帶較弱或不能檢測到相應的條帶。  試劑不合格；PCR儀有故障；擴增程序設置錯誤。  在兩臺不同的PCR儀上用新鮮購買的試劑與老的試劑分別進行PCR，比較其擴增產物結果。
  復性條件不是最合適的。  重新計算引物Tm；應用降落PCR，最好再結合熱啟動PCR。
驗證引物濃度，如果必要可優化引物的濃度；若引物顯然是問題的癥結所在，重新設計合成新的引物。
  被復性結合到模板上的引物不適合延伸。  優化MgCl2、模板DNA和dNTP的濃度；試驗此PCR的pH值的范圍；考慮用N-三甲基甘氨酸、N,N-二羥乙基甘氨酸或EPP等具有更低溫度變異系數的化學物質替代Tris（Cheng et al. 1994）。
應用新鮮制備的熱穩定DNA聚合酶。
重新純化模板DNA以去除抑制物。
在恒定復性溫度（55℃）條件下增加PCR循環數。
如果問題依然存在，添加增強劑（如10%二甲基亞砜，5% PEG6000或10%甘油）。
如果問題依然存在，用首次擴增的PCR產物進行1：100稀釋后作為模板，再加入新的PCR緩沖液與引物在恒定復性溫度條件下進行30個循環的第二次PCR擴增；或者進行嵌套式PCR擴增。
應用GC-Melt（CLONTECH）PCR反應混合液。
  變性不完全。  增加變性的時間或者設置更高的變性溫度。
  兩個引物之間的距離太大。  應用那些能夠擴增大DNA片段的熱穩定DNA聚合酶。
多種擴增產物條帶     應用降落PCR，最好再結合熱啟動PCR或加強PCR（booster PCR）。
優化MgCl2、模板DNA、熱穩定DNA聚合酶及dNTP的濃度。
用首次擴增的PCR產物進行1：100稀釋后作為模板，再加入新的PCR緩沖液與引物在恒定復性溫度條件下進行30個循環的第二次PCR擴增；或者進行嵌套式PCR擴增；或者從凝膠上切割目的條帶作模板重新進行PCR擴增。