實驗概要
日本Orita等研究發現，單鏈DNA片段呈復雜的空間折疊構象，這種立體結構主要是由其內部堿基配對等分子內相互作用力來維持的，當有一個堿基發生改變時，會或多或少地影響其空間構象，使構象發生改變，空間構象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同.因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構象上有差異的分子分離開.作者稱該方法為單鏈構象多態性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析.在隨后的研究中，作者又將SSCP用于檢查PCR擴增產物的基因突變，從而建立了PCR-SSCP技術，進一步提高了檢測突變方法的簡便性和靈敏性.其基本過程是：①PCR擴增靶DNA；②將特異的PCR擴增產物變性，而后快速復性，使之成為具有一定空間結構的單鏈DNA分子；③將適量的單鏈DNA進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳;④最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結果.若發現單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發生改變，就可以判定該鏈構象發生改變，進而推斷該DNA片段中有堿基突變.該方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器，適合臨床實驗的需要.但它也有不足之處.例如，只能作為一種突變檢測方法，要最后確定突變的位置和類型，還需進一步測序;電泳條件要求較嚴格;另外，由于SSCP是依據點突變引起單鏈DNA分子立體構象的改變來實現電泳分離的，這樣就可能會出現當某些位置的點突變對單鏈DNA分子立體構象的改變不起作用或作用很小時，再加上其他條件的影響，使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢.盡管如此該方法和其他方法相比仍有較高的檢測率.首先，它可以發現靶DNA片段中未知位置的堿基突變.Takao，經實驗證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發現，他認為現在知道的所有單堿基改變絕大多數可用該方法檢測出來.另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進一步提純.用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。
主要試劑
丙烯酰胺 TBE 變性劑石蠟油乙醇冰醋酸 AgNO3 NaCO3 1Kb Mark taq酶相應引物 dNTP等
實驗步驟
在小于1Kb長度的情況下，DNA片段長度與丙烯酰胺的濃度選擇如下:
DNA片段長度(核苷酸數) | 丙烯酰胺(%) |
1Kb～700b | 3.5 |
700b～500b | 5 |
500b～200b | 8 |
200b | 12 |
在進行SSCP前首先要通過PCR擴增出特異性好的產物(瓊脂糖電泳不能有過強的拖尾)。
1.制備聚丙烯酰胺凝膠(PAG)
按上表制所需的膠液，將梳子插入模子，從梳子一端加入膠，當膠液快到梳齒時，使模子向加膠端傾斜，繼續慢慢加膠，邊加邊放端模子以防止氣泡形成，室溫放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子，頂部加入1×TBE封閉，備用.
2.電泳
取10μlPCR產物，加入10μl變性劑(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.02%溴酚藍)、30μl 石蠟油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后將水相全部上樣，10-15℃下 電泳.開始在300V電壓下電泳5min，然后在120V電泳8h，取下凝膠，將其浸在含 0.5ug/ml溴化錠的1×TBE緩沖液中染色30--45min，在紫外燈下觀察，或進行銀染.
3.銀染法
將PAG板用去離子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去離子水洗二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去離子水洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中顯色7min.最后，用0.75%NaCO3終止顯色.
注意事項
SSCP是一種快速、簡便、靈敏的檢測基因突變的方法，為了使SSCP達到最佳效果，應 注意下列事項.
①重復性.影響SSCP重復性的主要因素為電泳的電壓和溫度.這兩個條件保持不變， SSCP圖譜可保持良好的重復性.一般SSCP圖譜是二條單鏈DNA帶，但有時有的DNA片段 可能只呈現一條SSDNA帶，或者三條以上，這主要是由于兩條單鏈DNA之間存在相似的 立體構象.有時三條以上的SSCP圖譜是由于野型DNA片段和突變型DNA片段共同存在的 結果.
②靶DNA序列長度的影響在實驗中發現SSCP對短鏈DNA或RNA的點突變檢出率要比長鏈 的高，這可能是由于長鏈DNA和RNA分子中單個堿基的改變在維持立體構象中起的作用 較小的緣故.而有人認為在DNA鏈較短的(400bp以下)情況下，DNA的長度不會影響SSCP 的效果.他們仔細選擇了實驗條件，發現354bp的DNA中點突變的檢出率仍可達到90%以 上.
③電泳電壓和溫度的影響:為了使單鏈DNA保持一定的穩定立體構象，SSCP應在較低溫度下進行(一般4℃-15℃之間).在電泳過程中除環境溫度外，電壓過高也是引起溫度升高的主要原因，因此，在沒有冷卻裝置的電泳槽上進行SSCP時，開始的5min應用較高的電壓(250V)，以后用100V左右電壓進行電泳.這主要是由于開始的高電壓可以使不同立體構象的單鏈DNA初步分離，而凝膠的溫度不會升高.隨后的低電壓電泳可以使之進一步分離.在實驗中應根據具體實驗條件確定電泳電壓.