具體的實驗步驟
cDNA第一條鏈的合成：
我們建議進行cDNA合成的對照反應，這樣可以對樣品的 cDNA的合成進行鑒定。加入各種試劑之后，在氣浴中42度保溫一個小時。
注意： 在水浴或酒精浴中保溫回減少反應體積，從而降低第一鏈的合成效率。
將管放于冰上，以終止第一鏈的合成反應。
直接進行第二鏈的合成。
cDNA第二鏈的合成：
第二鏈合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和連接酶。T4 DNA聚合酶的功能是補平dscDNA的末端。我們建議做陽性對照，試劑盒中提供人類骨骼肌的mRNA。
建議進行陽性對照,cDNA的質量取決于制備的polyA+RNA的質量。非哺乳動物樣品的mRNA大約在0.5－3kb之間。
通過電泳檢測cDNA的產量，與對照進行對比，這樣可以有利于在以后的步驟中對cDNA進行稀釋。
接頭的連接及連接產物的稀釋
按照程序進行連接反應。
如果沒有對比樣品和對照的產量，利用 Tricine－EDTA buffer制備接頭連接的ds cDNA的1/50和1/250的稀釋物，用兩種稀釋物進行以下的RACE PCR反應，直到鑒定出哪一種稀釋可以得到好的效果。
RACE－PCR擴增
進行5’和3’ 的RACE－PCR擴增。
利用以下的程序進行降落PCR反應：
注意：
我們建議使用降落PCR反應，這就要求GSP的Tm值≥70度。
當循環結束時，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析每一個管中的產物5μl，使用適當的分子量marker。
可以根據你的基因的特異性來設計最理想的循環參數。如果看不到帶或者只有微弱的帶，在68度多加5個循環。最佳的延伸時間取決于擴增條帶的長度。如果片斷的長度在2－5kb的時候，經常使用4min，0.2-2kb的時候將延伸時間減到2－3min，對于5－10kb的條帶，延伸時間增加到10min。
RACE產物的驗證：
應該對RACE的片段進行驗證,以此來確定是否已經擴增了理想的產物。如果得到的是多條帶或者研究的是多基因家族的成員，驗證是非常有用的。
有3種驗證RACE產物的方法：
（1）比較由GSP和NGSP獲得RACE產物。
（2）Southern blot
（3）克隆并測序
我們建議最好測得RACE產物的部分序列。有的時候需要嵌套引物的存在。
比較由GSP和NGSP獲得RACE產物
對于5‘末端的RACE產物，比較由AP1和GSP1擴增出來的產物和由AP1和NGSP1擴增出來的產物。
對于3‘末端的RACE產物，比較由AP1和GSP2擴增出來的產物和由AP1和NGSP2擴增出來的產物。這對于鑒定多條帶是否是上一個PCR的特異性產物是非常有用的。
如果條帶是正確的，在嵌套PCR反應中的條帶應該是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR產物的遷移率的不同取決于ｃＤＮＡ結構中GSP1和嵌套引物的位置。
RACE產物的克隆和測序：
可以利用膠回收試劑盒來回收RACE產物，此試劑盒適合回收2.5kb以下的RACE產物；對于長的片段，可以通過電洗脫獲得好的結果。如果你選擇使用其他的純化方法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新懸浮DNA樣品。
電泳 5μl回收的樣品來鑒定回收的質量。
將回收的PCR產物直接克隆到/A型的PCR克隆載體中。另外還可以利用接頭和/或cDNA合成引物中的 Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位點，將產物克隆到常規載體中.
對于5‘端的RACE產物，我們建議挑取至少8－10個不同的克隆以獲得5‘端的最大可能性的序列。（反轉錄并不總是進行到mRNA模板的5’末端，尤其是長模板。另外，T4 DNA聚合酶會移走5‘末端的0－20個堿基。）
一旦鑒定了含有插入片斷的克隆，應該獲得多的序列信息。理想的是，可以對整個開放讀碼框進行測序。包括5‘和3‘的非翻譯區。
全長cDNA 的獲得
通過部分或全部測序鑒定了RACE產物后，可以通過兩種選擇獲得全長的cDNA。
通過PCR的方法獲得全長cDNA：
擴增長的cDNA需要較長的延伸時間，但是如果延伸的時間過長，可以產生拖帶，所以要慎重的設計引物。
根據從5‘和
3‘RACE產物獲得序列信息設計5’和3‘GSP引物。這些引物應該來自cDNA的3’或者5‘的末端，應該是23－28nt長。不應該在引物的末端加上限制性位點，這樣會導致高背景。在某些時候可以設計3’和5‘的嵌套引物。但是還是應該先利用一對引物進行PCR反應。
進行如下的熱循環：
94度 30秒
25個循環 94度 5秒
72度 2－15分鐘
延伸的時間應該等于預期的cDNA長度加上2分鐘。例如：預期得到6kb的條帶，用6＋2＝8分鐘的延伸時間。
注意：如果沒有條帶或者條帶弱，增加 5個循環；或者優化PCR的條件。
在1.2%的瓊脂糖凝膠上分析5μl的樣品。通常情況下，可以見到一條單一帶，如果這樣，利用膠來純化全長的 cDNA。
制備1.2%的TAE buffer制備瓊脂糖凝膠。不使用TBE buffer，TBE的膠很難制備全長的cDNA。
將剩下的45μl反應物點樣，選用適當的marker。
利用長波紫外觀察cDNA（≧300nm）切下全長的cDNA。注意：應該盡量減少紫外對 cDNA的照射。
利用膠回收試劑盒回收cDNA。此試劑盒適合回收2.5kb以下的RACE產物；對于長的片段，可以通過電洗脫獲得好的結果。如果你選擇使用其他的純化方法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新懸浮DNA樣品。
將全長的cDNA克隆到T/A型的 PCR克隆載體中。
通過克隆產生全長的cDNA：
如果你已經獲得了含有重疊部分的5‘和3’RACE產物，同時在cDNA的重疊部分含有一個酶切位點的話，通過克隆技術可以獲得全長的cDNA。
利用酶切獲得的3‘和5’擴增產物，并且利用T4 DNA連接酶將它們連接起來。利用接頭和cDNA合成引物中的內切酶將最終的全長cDNA克隆到載體中。
在哺乳動物基因組中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大約106bp才出現一次，因此在絕大多數的cDNA中是不出現的。
Appendix：cDNA接頭和引物
接頭在設計的時候可以使cDNA的擴增成功進行：
接頭的5‘端在第一個循環中沒有AP1引物的結合位點。AP1的結合位點只有通過 GSP的擴增之后才能夠產生。
這些特點中的每一個都可幫助減少cDNA片段擴增過程中出現的非特異性擴增。另外，它們允許從一個復雜的DNA片段的混合物中擴增出靶樣品――所有的產物都有相同的末端結構，因為使用了單一的一套GSPs。