1 導論
聚合酶鏈式反應（PCR）以其優越性極大地影響到了分子生物學的幾乎所有領域，并以其基本程序和DGGE（denaturing gradient
gel electrophoresis），開發出多種檢測核苷酸變異的方法。 RAPD（Random Amplifed Polymorphic
DNA）就是其中的一種，它是1990年美國杜邦公司科學家 J. G. K. Williams和加利福尼亞生物研究所J.
Welsh領導的兩個小組幾乎同時發展起來的一項新技術。Williams稱之為 RAPD，Welsh叫它AP-PCR（Arbitrary
Primer PCR）（Welsh J et al, Nucl Acids Res, 1990(18):7213; Williams J G K
et al, Nucl Acids Res,
1990(18):6531）。與常規PCR相比，RAPD主要有以下的自身特點：①無需專門設計RAPD擴增反應的引物，也無需預知被研究的生物基因組核苷酸順序，引物是隨機合成或是任意選定的。引物長度一般為9～10個寡核苷酸。②每個RAPD反應中，僅加單個引物，通過引物和模板DNA鏈隨機配對實現擴增，擴增沒有特異性。③退火溫度較低，一般為36℃，這能保證短核苷酸引物與模板的穩定配對，同時也允許了適當的錯誤配對，以擴大引物在基因組DNA中配對的隨機性。④較之常規PCR，RAPD反應易于程序化。利用一套隨機引物，得到大量DNA分子標記，可以借助計算機進行系統分析。
RAPD作為單引物的PCR擴增產物，其產生機理是引物首先結合到模板鏈，沿模板5’端方向延伸而產生不同長度的DNA片段，然后以這些片段為模板繼續大量擴增。由于RAPD反應中，在3’端沒有相應引物和模板互補，這樣必然存在一個由引物沿模板DNA
5’端方向延伸后再在3’端形成同一引物互補序列的過程。有人提出，在RAPD反應過程中，擴增可能存在一些這樣的分子模式：①5’端帶有引物的單鏈DNA分子在3’端發生折轉、自身結合和延伸，并在3’端形成同一引物的互補序列，變性展開后即可成為單引物PCR擴增的模板分子。②通過兩條5’端各帶同一引物的單鏈DNA分子拼聯來實現。③對基因組DNA分子的顛倒重復序列而言，如果引物的結合位置正好處于這些序列的3’端，那么在其DNA片段的兩條單鏈上就分別具有一個引物的結合位置和它互補的序列，成了RAPD擴增的模板分子。在雙引物通用PCR中這種情況很少，但由于RAPD所用引物短，又在低溫下退火，這增加了引物和顛倒重復序列結合的機會，完全有可能產生RAPD。
2 試驗條件
【藥品試劑】
模板DNA（10～100ng）
寡核苷酸引物（20mmol/L貯存液，可向Operon Technologies或Perkin Elmer公司購買，也可以自己合成）
0.2 mmol/L dNTPs（必須使用高質量的dNTPs，這一點非常重要。dNTPs經反復化凍后會發生降解，因此應分成小份保存。應注意混合物中四種dNTP的量要相等）
Taq DNA 聚合酶（Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut）
10×PCR緩沖液（500 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L Tris·HCl, pH 8.3）
礦物油
電泳所需試劑
【儀器設備】 (生物秀實驗頻道——專業生物實驗中心 www.bbioo.com)
PCR擴增儀
電泳裝置
微量離心機
微量移液器（1～20ml和20～200ml）
0.5 ml Eppendorf管
紫外線觀察裝置及照相設備
3 操作程序
（1）在冰里向無菌的Eppendorf管中加入以下反應物：
水 14.75 ml
10×緩沖液 2 ml
10×dNTPs 2 ml
引物（20 mmol/L） 0.2 ml
Taq DNA聚合酶
終體積
DNA（10～100ng） 1 ml
石蠟油 20ml
（2）93℃反應2 min后開始如下循環：
93℃ 變性反應1min
36℃退火反應1min
72℃延伸反應1.5min
經過45個循環后，最后一個循環72℃增加5min，循環結束后反應產物置于4℃保存。
（3）20ml反應產物走凝膠電泳，經溴化乙錠染色檢測擴增的情況。
4 應注意的問題及其解決方法
（1）擴增偏差或無擴增。
――在部分或全部管中缺少一個組分。重復少量幾個反應以確定所有的PCR組分是否都已加入。
――PCR抑制物可能與DNA一起純化，改變DNA的濃度。
――在DNA分離中加入一個清洗步驟（如苯酚抽提）。
――稀釋新的DNA溶液。
――引物母液失效。重新配制母液，使用不同的引物或提高引物濃度。
――延長退火時間（在 PCR程序中的第二部分），或降低升溫轉換步驟之間的速率。
――提高每個反應中的Taq聚合酶的濃度。
――補加新的組分，該滅菌的都高壓滅菌。