RNA實驗和方案新手必讀（七）

在使用紫外通透的塑料比色杯的分光光度計中，測量260 nm的吸光值(A260)以確定RNA的濃度。為了確保獲得有意義的結果，讀值應在0.15與1.0之間。在260 nm波長下，1個單位的吸光值對應每毫升44 μg的RNA濃度（A260=1 → 44 μg/ml；基于標準的1 cm測光距離）。這一相關性僅對中性pH值條件下的檢測有效。因此，如需稀釋RNA樣品，則應使用中性pH值的低鹽緩沖液（例如10 mM Tris?Cl ，pH7.0）。

在檢測RNA樣本時，需確保比色杯中去除了RNA酶，特別是在使用分光光度測定之后仍需回收這些RNA的情況下。這可以通過使用0.1 M NaOH，1mM EDTA和不含RNase的水的順序洗滌來實現。使用稀釋RNA的緩沖液為分光光度計設定空白對照。列舉一個RNA定量中的計算實例如下：

RNA定量舉例
RNA樣品的體積= 100 μl
稀釋=10 μl RNA樣品+490μl 10 mM Tris?Cl ，pH 7.0（1/50的稀釋比）
使用1 ml（已去除RNA酶）比色杯，檢測稀釋后樣本的吸光度
A260 = 0.2

RNA濃度
= 44 μg/ml x A260 x稀釋系數
= 44 μg/ml x 0.2 x 50 
= 440 μg/ml

RNA總量 
=濃度x以毫升為單位的樣品體積
= 440 μg/ml x 0.1 ml 
= 44 μg RNA

RNA純度

在260 nm與280 nm讀值之間的比例（A260/A280）能夠反映RNA的純度，因為如蛋白一類的污染物會吸收紫外光。不過，A260/A280的比值也受到pH值的顯著影響。當使用沒有緩沖能力的水時，pH值與A260/A280的比值結果都會發生大范圍的改變。 較低的pH值會導致A260/A280的比值變小，對蛋白質污染的敏感性也會隨之降低（3）。

為了獲得精確的比率，我們建議在微堿的低鹽緩沖液中檢測吸光度（例如10 mM Tris?Cl，pH7.5）。在10 mM Tris?Cl，pH 7.5緩沖液當中，純RNA的A260/A280 比率約為1.9–2.1。

注：某些分光光度計在檢測純RNA時，可常規獲得高達2.3的比值。

請確保使用同種溶液校準分光光度計。不過，為了準確確定RNA的濃度，我們仍建議使用中性緩沖液稀釋RNA樣本，因為吸光度和濃度（A260讀值為1相當于44 μg/ml的RNA濃度）之間的關系是一個基于中性條件獲得的吸光系數。

RNA的完整度

總RNA的完整度和大小分布可以通過變性的瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色或市售的檢測系統（如QIAxcel系統或Agilent 2100 ）進行檢測。每條核糖體RNA的富集區域在凝膠染色之后應顯現為銳利的條帶。28S核糖體RNA的條帶亮度應為18S rRNA條帶的兩倍左右。如果某一泳道中核糖體RNA條帶不夠銳利，卻出現小尺寸RNA的彌散情況，則很可能因為RNA樣品在制備過程中發生了嚴重的降解。

Agilent 2100 Bioanalyzer也能夠提供RNA完整數目（RNA Integrity Number，RIN）這一參數，作為對RNA完整度的一個有用量度。在理想情況下RIN值應接近10，不過在許多情況下（特別是對組織樣本來說），RNA品質主要取決于原始樣本的保存情況。