RTPCR實驗流程

1、技術原理

實時熒光定量PCR是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時檢測整個PCR進程，zui后通過Ct值與標準曲線的處理對未知樣本進行定量分析，是zui常用的基因表達分析技術。有絕對定量與相對定量兩種定量分析方法。

圖 各種熒光定量曲線示意圖

2、服務流程及質控

2.1 實驗流程

• 樣本的質檢

• Nanodrop精準測定，樣本消耗量低。

• 引物設計

• 有著多年的經驗，比較透徹地掌握這方面的規律。

• 內參基因的選擇

• 客戶自己提供，我們進行驗證；

• 我們選擇多個內參，進行特定實驗優選；

• 很據實驗或客戶需求，可同時進行雙內參校正

• 檢測平臺

• ABI 7500（96 well），50ul 標準體系，滿足少量實驗需求。

• ABI 7900（384 well），20ul標準體系，滿足大量實驗需求，對照設在同板，結果均一。

2.2 實驗質控

• 實驗嚴格分區

• 防控污染zui有效的方法。

• 可靠的數據

• Ct值在18-30間，數據較準確；

• 與樣本原始濃度、RT效率及PCR效率有關；

• 反應效率隨設計引物差異而相差幾十倍，優化的引物使得實驗效率zui大化；

• 長期實驗證實：較長的引物使實驗效率顯著改進，但易引起非特異，通過實驗進一步優化而避免。