隨機引物 適用于長的或具有發卡結構的RNA。適用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反轉錄反應。主要用于單一模板的RT-PCR反應。 Oligo dT 適用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要結合到PolyA 尾巴上，所以對RNA樣品的質量要求較高，即使有少量降解也 會使全長cDNA合成量大大減少。 基因特異性引物 與模板序列互補的引物，適用于目的序列已知的情況。天為時 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特別適合于與基因特異性 引物連用。
PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異
性擴增帶與非特異性擴增帶。
原因 | 建議 | |
引物 | 引物特異性差 | 重新設計引物，改變引物的位置和長度，增強其特異性或使用巢式PCR |
引物濃度過高 | 適當減少引物濃度 | |
Mg2+濃度 | Mg2+濃度過高 | 適當降低Mg2+濃度，從1mM到3mM，間隔0.5mM進行一系列反應，確定對于每個模板和引物對的最佳鎂離子濃度。 |
耐熱聚合酶 | 酶量過多 | 以0.5U為間隔適當減少酶量 |
退火溫度 | 退火溫度過低 | 適當提高退火溫度或采用二階段溫度法 |
PCR循環次數 | PCR循環次數過多 | 減少PCR循環次數 |
4. 操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度；
5. 最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管