RTPCRPROTOCOL

RT-PCR PROTOCOL

材料與方法…………………………………………………………

    1．材料 ………………………………………………………

1.1 供試用組織(細胞)…………………………………

1.2 主要儀器設備………………………………………

1.3 主要試劑……………………………………………

1.4 工具酶及試劑盒……………………………………

    2.實驗方法……………………………………………………

2.1     總RNA提取…………………………………………

2.2 RT-PCR………………………………………………

2.3     瓊脂糖凝膠電泳……………………………………

材料與方法

1.    材料

1.1    供試用動物組織/細胞

1.2    主要儀器設備

1.5ml離心管、0.2ml PCR管、高速離心機、5~10ul加樣器、2~20ul加樣器、20~200ul加樣器、TAKARA  PCR儀、551可見光透射儀

1.3    主要試劑

RNAlocker、RNAout、RNAsaver、氯仿、異丙醇、75%乙醇、瓊脂糖、SYBRGREEN I染料。

1.4    工具酶及試劑盒

TaKaRa One Step RNA PCR Kit

2.    方法

2.1    RNA提取和純化

估算RNAout、組織或細胞的用量。取組織或細胞后，將剩余的組織或細胞放入RNAlocker中保存以備下次使用。將組織或細胞勻漿后，加入1.5ml離心管。加入0.2倍RNAOUT體積的氯仿，振蕩混勻30秒。室溫離心15000g 3分鐘。將上清液轉移到另一干凈離心管中。在上清液中加入等體積的異丙醇,振蕩器上振蕩混均30秒。室溫離心15000g 5分鐘，RNA沉淀將在離心底的側面形成，小心吸棄上清液。清洗：在含RNA沉淀的離心管中加入1毫升75%乙醇,振蕩器上振蕩混均30秒。室溫離心15000g,1分鐘。小心吸棄上清液。重復清洗步驟。將離心管倒置于濾紙上以干燥RNA。加DEPC水使RNA沉淀溶解，剩余的RNA沉淀使用RNAsaver溶解以備下次使用。

2.2    RT-PCR

2.2.1    取TaKaRa One Step RNA PCR Kit，按下列組成配制RT-PCR反應液。

10×One Step RNA PCR Buffer                   5μl

 MgCl₂(25mM)                               10μl

dNTP Mixture(10mM)                        5μl

Rnase Inhibitor(40U/μl)                  1μl

AMV RTase XL(5U/μl)                      1μl

AMV-Optimized Taq(5U/ul)                  1μl

上游特異性引物（20μM）                       1μl

下游特異性引物（20μM）                       1μl

Positive Control RNA或實驗樣品（≤1μg total RNA）^*         1μl

 Rnase Free dH₂O                           24μl

        Total                          50μl/Sample

^*當目的RNA的表達數量較少時，可加至25μl。同時在反應體系中相應地應叫少Rnase Free dH₂O的量。

2.2.2    按以下條件進行RT-PCR反應。

50℃   30min        RT反應

94℃   2min         RTase失活

94℃   30sec

37℃~65℃   30sec

72℃   1~10min      PCR反應25~30循環

●    當RNA為Positive Control RNA時，反應條件如下。

50℃       15min         RT反應

94℃       2min          RTase失活

94℃       30sec

60℃       30sec

72℃       1.5min         25~30循環

2.2.3  反應結束后，取PCR反應液 (5 ~ 10 ?l) 進行瓊脂糖凝膠電泳，確認RT-PCR反應產物。

如果此PCR產物需用于以后實驗，應將PCR產物冷凍保存。

Control反應時擴增片段大小為462 bp。

2.3    RT-PCR產物確認

電泳后，將SYBRGREEN I染色的凝膠用可見光透射儀觀察結果，確認RT-PCR產物。