2、反應混合液配制
在0.5mL Eppendorf管中加入下列試劑：
稀釋DNA 2 μL
primer 各0.5 μL
10×PCR Buffer 2.5 μL
dNTP 2 μL
MgCl2 1.5 μL
Taq酶 0.2 μL
加dd H20至總體積 25 μL
加完樣后，加一滴石蠟油，離心混勻。放入PCR儀，蓋好蓋子。
3、SSR擴增程序
94℃ 3 min
94℃ 30sec
Tm ( 48-65℃) 50sec 40cycles (退火溫度視引物而定)
72℃ 1 min
72℃ 7 min
反應結束后，取出10 μL左右用于電泳檢測。
二、電泳檢測
1、安裝膠模
將準備灌膠的玻璃板、間隔片、梳子等，用去污劑洗滌，自來水沖洗，涼干，酒精檫拭。按要求組裝好灌膠裝置。
2、配制丙烯酰胺溶液
根據所用玻璃板的大小和間隔片的厚度，估計所需丙烯酰胺溶液的體積。不同濃度的膠各成分配比如下表(總體積100 mL)：
|
試劑 |
配制不同濃度凝膠所用試劑的體積 |
|
3.5% 5.0% 8.0% 12.0% 20.0% |
|
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40%丙烯酰胺(mL) |
8.7 12.5 19.9 30.0 50.0 |
|
dd.H2O(mL) |
70.6 66.8 59.4 49.3 29.3 |
|
5×TBE(mL) |
20 20 20 20 20 |
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10%過硫酸胺(mL) |
0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 |
|
TEMED(mL) |
35 35 35 35 35 |
3、灌膠
將配制好的溶液倒入膠模，速度均勻流暢，防止引入氣泡。將玻璃板斜靠、靜置，小心插入梳子，等其凝固。檢查膠液是否流出。
4、丙烯酰胺的聚合
30-60分鐘后，觀察膠液是否聚合。聚合完后，在梳子下方可以看見折射不同的紋線。
5、拔梳子
用1×TBE浸潤凝膠的頂端2-4分鐘，小心拔出梳子。立即用1×TBE沖洗一下加樣孔，以防止梳子所留存的少量丙烯酰胺溶液在加樣孔聚合，產生不平整的表面。
6、凝膠的裝載
將膠模夾在電泳槽上，膠模與電泳槽接觸的邊緣用熱瓊脂糖（50℃左右）封邊。 7、加入電泳緩沖液
在電泳槽內加滿1×TBE溶液。用灣頭吸管或注射器排除氣泡。
8、加樣
用吸管吹打，使加樣孔整齊劃一。用小移液槍頭或注射器針頭加入PCR反應產物（已加過上樣緩沖液）。
9、電泳
接好電極，以1-8V/cm電泳。
10、紫外檢測
電泳結束后，小心取出膠板，放入0.5 mg/mL的EB溶液中，室溫染色15分鐘。在紫外燈下檢測DNA條帶。記錄其多態。
結果分析
每個擴增樣品會呈現若干條帶，分子量大小一般為幾百bp。
同一模板，不同引物擴增時，擴增結果往往不同。
同一引物，不同模板擴增時，擴增結果往往不同。
實驗中要調整退火溫度、模板用量、反應時間等條件，以達到最好的擴增效果。
小心使用丙烯酰胺、EB等有害物質，禁止污染。