制備基因組 DNA 樣品首先要經過一種或多種限制性內切核酸酶的消化，消化后的片段在標準的瓊脂糖凝膠上經電泳按照大小進行分離。DNA 經過原位變性后，從凝膠上轉移到固相支持物上（通常為尼龍膜或者硝酸纖維素膜）。DNA 片段在向膜轉移的過 程中被保留于相應的位置。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 制備基因組 DNA 樣品首先要經過一種或多種限制性內切核酸酶的消化，消化后的片段在標準的瓊脂糖凝膠上經電泳按照大小進行分離。DNA 經過原位變性后，從凝膠上轉移到固相支持物上（通常為尼龍膜或者硝酸纖維素膜）。DNA 片段在向膜轉移的過 程中被保留于相應的位置。 |
|---|
| 實驗材料 | 適當的限制性內切核酸酶無溴化乙錠的瓊脂糖凝膠基因組 DNA |
|---|
| 試劑、試劑盒 | 堿性轉移緩沖液變性溶液中和緩沖液中性轉移緩沖液 |
|---|
| 儀器、耗材 | 無溴化乙錠的瓊脂糖凝膠交聯設備玻璃烤盤大口徑的黃吸頭氯丁橡膠塞尼龍或硝酸纖維素膜樹脂玻璃片或玻璃碟旋轉振蕩平臺厚的吸水紙熒光標記的透明尺 |
|---|
| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液及溶液
堿性轉移緩沖液（應用于尼龍膜的堿性轉移）（0.4 mol/L NaOH，1 mol/L NaCl）
變性溶液（應用于中性轉移）（1.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L NaOH，HCl ( 0.2 mol/L)，應用于 DNA 的脫嘌呤）
中和緩沖液Ⅰ( 應用于不帶電荷的尼龍膜的轉移）（1 mol/L Tris ( pH 7.4)，1.5 mol/L NaCl）
中和緩沖液Ⅱ (應用于尼龍膜的堿性轉移）（0.5 mol/L Tris-Cl ( pH 7.2)，1 mol/L NaCl）
中性轉移緩沖液（10X SSC 或 10X SSPE)（6X SSC，6X 蔗糖凝膠上樣緩沖液，SYBR Gold 或溴化乙錠，TE ( pH 8.0)）
2. 酶及緩沖液
適當的限制性內切核酸酶
3. 凝膠
用 0.5X TBE 或 1X TAE 配制的無溴化乙錠的瓊脂糖凝膠（0.7%)
4. 核酸及寡核苷酸
DNA 大小標記物
基因組 DNA
5. 專用設備
交聯設備（例如 Stratalinker, Stratagene; GS Gene Linker, Bio-Rad), 或者微波爐，或真空爐
玻璃烤盤
大口徑的黃吸頭
氯丁橡膠塞
尼龍或硝酸纖維素膜
樹脂玻璃片或玻璃碟
旋轉振蕩平臺
厚的吸水紙（例如，Whatman 3 MM, Schleicher&Schuell GB004, 或 Sigma QuickDraw)
熒光標記的透明尺
重物（400 g )
二、方法
1. DNA 的消化及電泳
(1) 用一種或幾種限制性內切核酸酶消化適當數量的 DNA。
使用大口徑黃吸頭操作大分子 DNA。
(2) 如果需要，消化結束后用乙醇沉淀濃縮 DNA 片段。將 DNA 溶解于約 25 μl TE( pH 8.0)。
(3) 通過熒光測量法或者溴化乙錠或 SYBR Gold 斑點實驗測定 DNA 消化產物的濃度。將適量的消化產物轉移到新的微量離心管中。加入 0.15 倍體積的蔗糖上樣緩沖液，通過瓊脂糖凝膠電泳分離 DNA 片段（對于大部分基因組 DNA, 可以使用 1X TAE 或 0.5X TBE 配制的 0.7% 的凝膠）。對凝膠加一較低的電壓（約 < 1 V/cm) 使 DNA 以較慢的速率遷移。
(4) 電泳充分進行后，將凝膠用溴化乙錠或 SYBR Gold 染色然后照相。在凝膠一側放置一把透明熒光尺以便從照片上直接讀出每一 DNA 條帶遷移的距離。
(5) DNA 變性，使用下列方法之一將 DNA 從凝膠上轉移到硝酸纖維素膜或者中性或帶電荷的尼龍膜上。
2. 準備用于轉移的凝膠
(1) 電泳分離 DNA 之后，將凝膠轉移到一玻璃烤盤中。用鋒利的剃須刀片修去凝膠邊緣無用的部分，包括加樣孔上方的凝膠。在凝膠上保留足夠的加樣孔以便 DNA 轉移結束后將加樣孔的位置標記于膜上。在凝膠左下角切去一小三角形（加樣孔一端為下)，以此作為以下操作過程中凝膠方位的標記。
(2) 按以下步驟將凝膠置于變性溶液（堿性）中進行 DNA 變性。
① 轉移到不帶電荷的膜上
A. 將凝膠置于 10 倍于凝膠體積的變性溶液中室溫下放置 45 min 并且輕輕振蕩（例如，放在一個振蕩平臺上）。
B. 用去離子水短暫浸泡凝膠，然后將凝膠浸于 10 倍于凝膠體積的中和緩沖液Ⅰ中室溫下放置 30 min, 并輕輕振蕩。換一次中和緩沖液繼續浸泡凝膠 15 min。
② 轉移到帶電荷的尼龍膜上
A. 室溫下將凝膠浸于數倍體積的堿性緩沖液中 15 min 并輕輕振蕩（例如，放在一個振蕩平臺上)。
B. 換液一次繼續浸泡凝膠 20 min, 并輕輕振蕩。
3. 準備轉移用膜
(1) 用干凈的解剖刀或切紙機切一張每邊均比凝膠大 1 mm 的尼龍膜或硝酸纖維素膜。再切兩張與膜同樣大小的厚吸水紙。
(2) 將膜漂浮于盛有去離子水的皿中直到膜從下往上完全浸濕，然后將膜浸入適當的轉移緩沖液中至少 5 min。用干凈的解剖刀片切下膜的一角，與凝膠切下的一角相一致。
4. 組裝轉移裝置及 DNA 的轉移
將 DNA 轉移至不帶電荷的膜時需使用中性轉移緩沖液（10X SSC 或 10X SSPE)。 堿性轉移緩沖液 0.4 mol/L 的 NaOH 及 1 mol/L 的 NaCl 應用于將 DNA 轉移至帶電荷的尼龍膜時。
(1) DNA 進行變性的過程中，將一張厚的吸水紙放在一片樹脂玻璃板或玻璃皿上形成比凝膠長且寬的支持物。吸水紙兩端需要從皿的邊緣垂下。將支持物放于一個大的干烤皿中。支持物可以放在四個氯丁橡膠塞上將其從皿的底部墊高。
(2) 皿中放入適當的轉移緩沖液直到液面幾乎與支持物表面平齊。當支持物上的吸水紙完全濕潤后，用一只玻璃棒或吸管趕走氣泡。
(3) 將凝膠從溶液中取出并倒轉使原來的底面向上。將倒轉的凝膠放在支持物上并位于吸水紙中央。
(4) 用 Saran 包裝膜或 Parafilm 膜圍繞凝膠四周，但不要覆蓋凝膠。
易從凝膠邊緣垂下并與平臺接觸。這種短路是 DNA 從凝膠向膜轉移效率低下的主要原因。
(5) 用適當的轉移緩沖液將凝膠濕潤。將濕潤的膜放置于凝膠上并使兩者切角相重疊。為避免產生氣泡，應當先使膜的一角與凝膠接觸再緩慢的將膜放到凝膠上。膜的一條邊緣應恰好超過凝膠上部加樣孔一線的邊緣。
重要：膜一旦放在凝放表面就不要再移動了。膜與凝膠之間不應留有氣泡。
(6) 用適當的轉移緩沖液濕潤兩張厚的吸水紙并放置于濕潤的膜上。用吸管趕走滯留的氣泡。
(7) 切或者疊一疊略小于吸水紙的紙巾（5~8 cm 高)。將紙巾放在吸水紙上。在紙巾頂部放一塊玻璃板然后用一 400 g 重物壓實。
(8) DNA 轉移需進行 8~24 h。當紙巾濕潤后更換新的紙巾。盡量避免整疊紙巾都被緩沖液浸濕。
(9) 除去凝膠上的紙巾以及吸水紙。翻轉凝膠以及與之接觸的膜，凝膠向上平放于干燥的吸水紙上。用一支極軟鉛筆或圓珠筆標記加樣孔的位置。
(10) 將凝膠從膜上剝離，棄去凝膠。
5. 固定 DNA 于膜上
從將 DNA 固定于膜上到其后的雜交，這一系列步驟的順序取決于膜的種類、轉移的方法以及固定的方法。由于堿性緩沖液將導致 DNA 共價結合于帶正電荷的尼龍膜上，因此在雜交前不需要將 DNA 固定在膜上。在中性緩沖液中轉移至不帶電荷的尼龍膜的 DNA 需要真空烘烤或者用微波爐加熱以固定于膜上，或者用紫外照射交聯于膜上。
(1) 將膜浸于適量的下列溶液之一：
中性轉移：6X SSC，室溫 5 min。
堿性轉移：中和緩沖液Ⅱ [ 0.5 mol/L Tris-Cl ( pH 7.2) 及 1 mol/L NaCl ], 室溫 15 min。
(2) 固定已經轉移到不帶電荷的膜上的 DNA
① 通過真空烤箱來固定
A. 將膜從 6X SSC 中取出并使多余的液體流凈。將膜放在紙中上室溫下晾干 30 min。
B. 將膜夾在兩張干燥的吸水紙中間。在真空爐中 80℃ 烘烤 30 min~ 2 h。
② 用微波爐烘烤固定
A. 將潮濕的膜放在一張干燥的吸水紙上。
B. 將微波爐調至最大功率（750~900 W) 對膜加熱 2~3 min。
③ 通過紫外照射交聯
A. 將潮濕的膜放在一張干燥的吸水紙上。
B. 254 nm 照射使 DNA 交聯到膜上（Khandjian 1987)。
(3) 直接用探針對固定化的 DNA 進行雜交。 |
|---|
