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  • 發布時間:2020-09-01 12:22 原文鏈接: Western印跡法(試劑配制和操作步驟)2

    (二)使用液

    單去污劑裂解液(50mmol/L Tris?HCl pH8.0,150mmol/L NaCl,1%TritonX-100,100?g/ml PMSF):
    1mol/L Tris?HCl(pH8.0) 2.5ml
    NaCl 0.438g
    TritonX-100 0.5ml
    蒸餾水至 50ml
    混勻后, 4℃保存。使用時,加入PMSF至終濃度為100?g/ml(0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl)。

    0.01mol/L PBS( pH 7.2-7.4)
    0.2 mol/L NaH2PO4 19ml
    0.2 mol/L Na2HPO4 81ml
    NaCl 17g
    蒸餾水至 2000ml

    G250考馬斯亮藍溶液(測蛋白含量專用)
    考馬斯亮藍G250: 100mg
    95%乙醇: 50ml
    磷酸: 100ml
    蒸餾水至 1000ml
    配制時,先用乙醇溶解考馬斯亮藍染料,再加入磷酸和水,混勻后,用濾紙過濾,4℃保存。

    0.15 mol/L NaCl
    NaCl(MW58.44) 0.877g
    蒸餾水至 100 ml
    高溫滅菌后,室溫保存。

    100mg/ml 牛血清白蛋白(BSA)
    BSA 0.1g
    0.15 mol/L NaCl 1ml
    溶解后,-20℃保存。制作蛋白標準曲線時,用0.15 mol/L NaCl進行100倍稀釋成1mg/ml,-20℃保存。

    10%分離膠和4%濃縮校
    10%分離膠(兩塊膠,10ml) 4%濃縮膠(兩塊膠,5ml)
    超純水 4.85ml 3.16ml
    40%Acr/Bic(37.5:1) 2.5ml 0.5ml
    1.5 mol/L Tris?HCl(pH8.8) 2.5ml -
    0.5 mol/L Tris?HCl(pH6.8) - 1.26ml
    10%SDS 100 ml 50 ml
    10%AP(過硫酸胺) 50 ml 25 ml
    TEMED 5 ml 5 ml
    加 TEMED后,立即混勻即可灌膠。

    還原型5XSDS上樣緩沖液(0.25mol/L Tris?HCl pH6.8,0.5mol/L二硫叔糖醇,10% SDS,0.5%溴酚藍,50%甘油)
    0.5 mol/L Tris?HCl(pH6.8) 2.5ml
    二硫叔糖醇(DTT,MW154.5) 0.39g
    SDS 0.5g
    溴酚藍 0.025
    甘油 2.5ml

    混勻后,分裝于1.5ml離心管中,4℃保存。

    電泳液緩沖液(25mmol/L Tris,0.25mol/L甘氨酸,0.1% SDS)
    Tris(MW121.14) 3.03g
    甘氨酸(MW75.07) 18.77g
    SDS 1g
    蒸餾水至 1000ml
    溶解后室溫保存,次溶液可重復使用3~5 次。

    轉移緩沖液(48mmol/L Tris,39mmol/L甘氨酸,0.037% SDS,20%甲醇)
    甘氨酸(MW75.07) 2.9g
    Tris(MW121.14) 5.8g
    SDS 0.37g
    甲醇 200ml
    蒸餾水至 1000ml
    溶解后室溫保存,次溶液可重復使用3~5次。

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