這種技術是把電泳分離的組分從凝膠轉移到一種固相支持體，并以針對特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測之。Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現的抗原表位發生特異性反應。這種技術的作用是對非放射性標記蛋白組成的復雜混合物中的某些特異蛋白進行鑒別和鑒定。
儀器：高壓鍋、玻璃勻漿器、高速離心機、分光光度儀、—20℃低溫冰箱、垂直板電泳轉移裝置、恒溫水浴搖床、多用脫色搖床。
試劑：單去污劑裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分離膠、4％濃縮校、G250考馬斯亮藍溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉移緩沖液、10X麗春紅染液、封閉液、TBST、TBS、洗脫抗體緩沖液、顯影液、定影液、抗體、化學發光試劑。
雜品與耗材：各種規格的吸頭、離心管和加樣器；各種規格的燒杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纖維素膜，乳膠手套，保鮮膜，搪瓷盤（>20×500px），X-光片夾，X-光片，玻棒長短各一根，計時器，吸水紙，
試劑配制：
（一）母液
1.0mol/L Tris?HCl
Tris (MW121.14) 30.29g
蒸餾水 200ml
溶解后，用濃鹽酸調pH至所需點（見下所示），最后用蒸餾水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。
PH HCl
7.4 約17ml
7.5 約16m
7.6 約15ml
8.0 約10ml
1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF
PMSF 0.174g
異丙醇 100ml
溶解后，分裝于1.5ml離心管中，－20℃保存。
0.2mol/L NaH2PO4
NaH2PO4（MW119.98） 12g
蒸餾水至 500ml
溶解后，高壓滅菌，室溫保存。
0.2mol/LNa2HPO4
Na2HPO4?12H2O（MW 358.14） 71.6g
蒸餾水至 1000ml
溶解后，高壓滅菌，室溫保存。
10％SDS
SDS 10g
蒸餾水至 100ml
50℃水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
10％過硫酸胺（AP）
過硫酸胺 0.1g
超純水 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存時間為1周。
1.5mol/L Tris?HCl（pH8.8）
Tris (MW121.14) 45.43g
超純水 200ml
溶解后，用濃鹽酸調pH至8.8，最后用超純水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。
0.5mol/L Tris?HCl（pH6.8）
Tris (MW121.14) 15.14g
超純水 200ml
溶解后，用濃鹽酸調pH至6.8，最后用超純水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。
40％Acr/Bic（37.5：1）
丙稀酰胺（Acr） 37.5g
甲叉雙丙稀酰胺（Bic） 1g
超純水至 100ml
37℃下溶解后，4℃保存。使用時恢復至室溫且無沉淀。
20％Tween20
Tween20 20ml
蒸餾水至 100ml
混勻后4℃保存。
（二）使用液
單去污劑裂解液（50mmol/L Tris?HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100?g/ml PMSF）：
1mol/L Tris?HCl（pH8.0） 2.5ml
NaCl 0.438g
TritonX－100 0.5ml
蒸餾水至 50ml
混勻后， 4℃保存。使用時，加入PMSF至終濃度為100?g/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。
0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）
0.2 mol/L NaH2PO4 19ml
0.2 mol/L Na2HPO4 81ml
NaCl 17g
蒸餾水至 2000ml
G250考馬斯亮藍溶液（測蛋白含量專用）
考馬斯亮藍G250： 100mg
95％乙醇： 50ml
磷酸： 100ml
蒸餾水至 1000ml
配制時，先用乙醇溶解考馬斯亮藍染料，再加入磷酸和水，混勻后，用濾紙過濾，4℃保存。
0.15 mol/L NaCl
NaCl（MW58.44） 0.877g
蒸餾水至 100 ml
高溫滅菌后，室溫保存。
100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）
BSA 0.1g
0.15 mol/L NaCl 1ml
溶解后，－20℃保存。制作蛋白標準曲線時，用0.15 mol/L NaCl進行100倍稀釋成1mg/ml，－20℃保存。
10％分離膠和4％濃縮校
10％分離膠（兩塊膠，10ml） 4％濃縮膠（兩塊膠，5ml）
超純水 4.85ml 3.16ml
40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml
1.5 mol/L Tris?HCl（pH8.8） 2.5ml －
0.5 mol/L Tris?HCl（pH6.8） － 1.26ml
10％SDS 100 ml 50 ml
10%AP（過硫酸胺） 50 ml 25 ml
TEMED 5 ml 5 ml
加TEMED后，立即混勻即可灌膠。
還原型5XSDS上樣緩沖液（0.25mol/L Tris?HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10％ SDS，0.5％溴酚藍，50％甘油）
0.5 mol/L Tris?HCl（pH6.8） 2.5ml
二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g
SDS 0.5g
溴酚藍 0.025
甘油 2.5ml
混勻后，分裝于1.5ml離心管中，4℃保存。
電泳液緩沖液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％ SDS）
Tris（MW121.14） 3.03g
甘氨酸（MW75.07） 18.77g
SDS 1g
蒸餾水至 1000ml
溶解后室溫保存，次溶液可重復使用3～5次。
轉移緩沖液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇）
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸餾水至 1000ml
溶解后室溫保存，次溶液可重復使用3～5次。
10X麗春紅染液
麗春紅S 2g
三氯乙酸 30g
磺基水楊酸 30g
蒸餾水至 100ml
使用時將其稀釋10倍。
TBS緩沖液（100mmol/ L Tris?HCl pH7.5,150mmol/L NaCl）
1 mol/ LTris?HCl（pH7.5） 10ml
NaCl 8.8g
蒸餾水至 1000ml
TBST緩沖液（含0.05％Tween20的TBS緩沖液）
20％Tween20 1.65ml
TBS 700ml
混勻后即可使用，最好現用現配。
封閉液（含5％脫脂奶粉的TBST緩沖液）
脫脂奶粉（國產，安怡牌） 5g
TBST 100ml
溶解后4℃保存。使用時，恢復室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用。
洗脫抗體緩沖液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2％SDS，62.5m mol/L Tris?HCl pH6.8）
14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巰基乙醇) 700 ml （通風廚里加）
SDS 2g
0.5mol/L Tris?HCl（pH6.8） 12.5ml
超純水至 100ml
配制時，在通風廚內進行。4℃保存。可重復使用1次。
顯影液（5X）
自來水（加熱至50℃） 375ml （以下藥品加到溫水中）
米吐爾 1.55g
亞硫酸鈉（無水） 22.5g
碳酸鈉（無水） 33.75g
溴化鉀 20.95g
補水至 500ml
配制時，上述藥品應逐一加入，待一種試劑溶解后，再加入后一種試劑。4℃保存。使用時用自來水稀釋至1倍。
定影液
自來水（50～60℃） 700ml （以下藥品按順序加入前者溶解后再加后者）
硫代硫酸鈉 240g
亞硫酸鈉（無水） 15g
冰乙酸 12.6ml
硼酸 7.5g
鉀明礬 15g（水溫冷至30℃以下時再加入）
加水定容至1000ml，室溫保存
抗體
用TBST稀釋至一定濃度使用，每張膜需0.5ml
化學發光試劑
購自北京中山公司，為Santa Cruz產品，分A和B兩種試劑。
操作步驟：
（一） 蛋白樣品制備
（1） 單層貼壁細胞總蛋白的提取：
1、倒掉培養液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液（或將瓶直立放置一會兒使殘余培養液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
2、每瓶細胞加3ml 4℃預冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1min洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養液。將PBS棄凈后把培養瓶置于冰上。
3、按1ml裂解液加10 ?l PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）
4、每瓶細胞加400 ?l含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動。
5、裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）
6、于4℃下12000rpm離心5min。（提前開離心機預冷）
7、將離心后的上清分裝轉移倒0.5min的離心管中放于－20℃保存。
（2）組織中總蛋白的提取：
1、將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
2、加400 ?l單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進行勻漿。然后置于冰上。
3、幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復碾幾次使組織盡量碾碎。
4、裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。
（3） 加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取：
由于受藥物的影響，一些細胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應收集培養液中的細胞。以下是培養液中細胞總蛋白的提取：
1、將培養液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。
2、棄上清，加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復洗滌一次。
3、 用槍洗干上清后，加100 ?l裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解。
4、 將裂解液與培養瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。
（二） 蛋白含量的測定
（1） 制作標準曲線
1、 從－20℃取出1mg/ml BSA，室溫融化后，備用。
2、 取18個1.5ml離心管，3個一組，分別標記為0mg，2.5mg，5.0mg ，10.0mg ，20.0mg ，40.0mg。
3、 按下表在各管中加入各種試劑。
0mg | 2.5mg | 5.0mg |
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