一、樣品制備
對于Western Blotting實驗而言，樣品處理是關鍵步驟之一，獲得的蛋白樣品必須均質、可溶，并解離成單個多肽亞基，且盡量減少相互間的聚集，使其最終僅依賴本身的分子量大小進行分離。當目標蛋白的含量很低時，需要選取目標蛋白含量較高的組織或細胞器（如核抽提物），或者通過免疫沉淀等方式進行富集。通常樣品有重組蛋白、細胞和組織等。
1. 樣品收集
1）培養的細胞
貼壁和懸浮細胞收集方式不同，細胞裂解液種類各異，推薦含SDS的凝膠加樣緩沖液裂解，煮沸即可。
2）動物組織
與細胞不同，組織塊由于體積較大，須預先經破碎勻漿處理。
2. 樣品定量
樣品電泳前需測定蛋白濃度，以便保證上樣量一致，有利于后續定量或半定量分析。常用的蛋白質濃度測定方法有好多種，其靈敏度和所需時間不同，且不同的方法會受不同干擾物質的影響，實驗者可根據樣品制備方法（裂解液成分、去垢劑和還原劑種類等）自行選擇。
幾種蛋白質濃度測定方法比較
| 優點 | 缺點 | |
| Bradford法 | 迅速、靈敏 | 對各種純化蛋白質反應不同 |
| BCA法 | 簡單、干擾少 | 耗時 |
| Lowry法 | 不同蛋白差別小 | 干擾多，較慢 |
注意事項：
a. 應盡量避免引入影響后續定量的雜蛋白（如細胞培養液、蛋白酶抑制劑等）及其他干擾物質；
b. 樣品濃度應適中，1×SDS凝膠加樣緩沖液建議用量：貼壁細胞按10cm2培養皿/0.1ml,懸浮細胞按5×106細胞/0.1ml比例加入；
c. SDS對蛋白質變性和電泳分離至關重要，濃度應控制在2-10%之間，并根據具體需要調整；
d. 制備好的樣品可以在-20℃保存，但時間不宜過長，并避免反復凍融，否則蛋白會發生降解；
e. 內參對實驗結果至關重要，應選擇合適的內參。
二、電泳
電泳分為非變形凝膠電泳和變性凝膠電泳，Western Blotting中常用的是不連續緩沖系統下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），該法中由于變性的多肽與SDS結合而帶負電荷，在凝膠電泳中遷移率僅與多肽的分子量相關。凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，而孔徑又是灌膠時所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對濃度的函數。
SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍
| 丙烯酰胺濃度（%） | 線性分離范圍（KD） |
| 15 | 12-43 |
| 10 | 16-68 |
| 7.5 | 36-94 |
| 5.0 | 57-212 |