實驗材料 RNA
試劑、試劑盒 α32PdNTPmRNA甲基氫氧化汞β-巰基乙醇RNase抑制劑引物01igo dTTris-HClMgCl2KCl逆轉錄酶EDTA酚-氯仿乙醇瓊脂糖HepesDTTDNA聚合酶核酸酶S1
儀器、耗材 SephadexG-100離心柱層析離心管恒溫水浴鍋電泳儀低溫離心機
實驗步驟
cDNA第一鏈的合成：
1.在Ependorf管中加50pmol/L的一種α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl（10μg）,100m mol/L甲基氫氧化汞1μl,室溫反應l0分鐘,使RNA變性.
2.加100m mol/l的β-巰基乙醇2μl和10m mol/l RNase抑制劑2μl,室溫放置5分鐘.β-巰基乙醇有穩定逆轉錄酶活性的作用.
3.向上述反應混合物加lmg／ml的引物01igo dT(12～18聚體)10μl,1mol／l Tris.HCl(pH8.3)5μl,11mol／l, KCl7μl,250m mol／l,MgCl22μl,再加20 m mol／l的4種dNTP各2.5μl,逆轉錄酶2μl（40單位）,用水補充到50μl,充分混勻,42℃反應1～3小時.
4.加0.5 EDTA(pH8.0)2μl終止反應,然后加150m mol／l NaOH 25μl,65℃反應1小時,或37℃8小時,水解mRNA模板,得到cDNA第一鏈,再加pH8.0,1m mol／l Tris.HCl,各25μl中和其pH.
5.測定放射活性,計算合成的DNA量.實際上,cDNA第一鏈的產量往往不會超過poltAmRNA用量的10%～30%.
6.用等體積的酚-氯仿抽提—次,取水相并用SephadexG-100離心柱層析將cDNA同剩余的dNTP分開,以2.5倍體積的95％冷乙醇沉淀.
7.合成的cDNA第—鏈在1.4％的堿性瓊脂糖凝膠上電泳,用末端標記的pBR322限制性片段為分子量標準,電泳后,鋪X-光片,進行放射自顯影,確定cDNA第一鏈的大小.
cDNA第二鏈的合成：
1.離心沉淀cDNA第一鏈,并重懸在50μl水中,加50μl 2×第二鏈緩沖液(0.2mol／l Hepes,pH6.9,20m mol／l MgCl2,5 m mol／l DTT,0.14 mol／l KCl,1 m mol／l 4種Dntp),混合均勻.
2.每微克底物加大腸桿菌DNA聚合酶K1enow片段20～50單位,15℃反應20小時,此酶能識別cDNA 3’末端發卡環,并以其為引物,cDNA第一鏈為模板,開始第二鏈的合成.
3.加0.5 mol／l EDTA 2μl終止反應.取樣電泳,以提取第一鏈同樣的方法分離沉淀dsDNA.對于這樣合成的dsDNA不是全長的DNA分子,所以,需要進一步用逆轉錄酶合成.
4.溶解上述dsDNA在20μl水中,再加入：1mol／l Tris.HCl pH8.3)5μl,1 mol／l KCl 7μl,250m mol／l MgCl2 2μl,20m mol／l 4種‘dNTP各2.5μl,700m mol／l β-MCE 2μl,加重煎水到48μl,加逆轉錄酶2μl (40單位)、42℃保溫反應1小時.
5.加0.5 mol／l EDTA 2μl終止反應,取樣電泳,以同樣方法抽提,分離沉淀dsDNA.
6.用兩次合成的雙鏈cDNA和單鏈cDNA在1.4％堿性瓊脂糖凝膠上電泳,放射自顯影后觀察,如果dsDNA片段的長度是第一鏈cDNA的兩倍,那么,合成便是成功的.
7.用核酸酶S1消化dsDNA,除去連接兩條鏈的發卡環.