分為六個階段：
階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈
階段2：cDNA第二鏈的合成
階段3：cDNA的甲基化
階段4：接頭或銜接子的連接
階段5：Sepharose CL-4B凝膠過濾法分離cDNA
階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接
[階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈]
1.在置于冰上的無菌微量離心管內混合下列試劑進行cDNA第一鏈的合成：
poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl
寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl
1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl
1mol/L KCl 3.5μl
250 mmol/L MgCl2 2μl
dNTP溶液（含4種dNTP，每種5mmol/L） 10μl
0.1 mol/L DTT 2μl
RNase抑制劑（選用） 25單位
加H2O至 48μl
2.當所有反應組在0℃混合后，取出 2.5μl反應液轉移到另一個0.5ml微量離心管內。在這個小規模反應管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi /ml）。
3.大規模和小規模反應管都在37℃溫育1h。
4.溫育接近結束時，在含有同位素的小規模反應管中加入 1μl 0.25mol/L EDTA，然后將反應管轉移到冰上。大規模反應管則在70℃溫育10 min，然后轉移至冰上。
5.參考《分子克隆實驗指南》第三版附錄8所述方法，測定0.5μl小規模反應物中放射性總活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合適的DNA 分子質量參照物通過堿性瓊脂糖凝膠電泳對小規模反應產物進行分析是值得的。
6.按下述方法計算cDNA第一鏈的合成量（推算方法略）：
[摻入的活度值(cpm)/總活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一鏈(μg)
7.盡可能快地進行cDNA合成的下一步驟。
[階段2：cDNA第二鏈的合成]
10 mCi/ml[α-32P] dCTP（400 Ci/mmol） 10μl
1 mol/L (NH4)2SO4 1.5μl
RNase H (1000 單位/ml) 1μl
大腸桿菌DNA聚合酶I (10 000單位/ml) 4.5μl
溫和振蕩將上述試劑混合，在微量離心機稍離心，以除去所有氣泡。在16℃溫育2~4h。
2.溫育結束，將下列試劑加到反應混合物中：
β-NAD (50 mmol/L) 1μl
大腸桿菌DNA連接酶(1000~4000單位/ml) 1μl
室溫溫育15min。
3.溫育結束，加入1μl含有4種 dNTP的混合物和2μl T4噬菌體DNA聚合酶。反應混合物室溫溫育15分鐘。
4.取出3μl反應物，按步驟7和8描述的方法測定第二鏈 DNA的質量。
5.將5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反應物中，用酚：氯仿和氯仿分別抽提混合物一次。在 0.3 mol/L(pH5.2)乙酸鈉存在下，通過乙醇沉淀回收DNA，將DNA溶解在90μl TE(pH7.6)溶液中。
6.將下列試劑加到DNA溶液中：
10×T4多核苷酸激酶緩沖液 10μl
T4多核苷酸激酶（3000單位/ml） 1μl
室溫溫育15 分鐘。
7.測定從上面步驟4取出的3μl反應物中放射性活度，并按分子克隆實驗指南》第三版附錄8所述方法測定1μl第二鏈合成產物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。
8.用下面公式計算第二鏈反應中所合成的 cDNA量。要考慮到已摻入到DNA第一鏈種的dNTP的量。
[第二鏈反應中所摻入的活度值(cpm)/總活度值(cpm)]* (66μg -xμg)=cDNA第二鏈合成量/μg
x表示cDNA第一鏈量。CDNA第二鏈合成量通常為第一鏈量的70~80%
9. 用等量酚：氯仿對含有磷酸化cDNA（來自步驟6）的反應物進行抽提。