gRNA讓CRISPR基因組編輯技術的準確性平均提高50倍

　　在一項新的研究中，來自美國杜克大學的研究人員開發出一種方法，可將CRISPR基因組編輯技術的準確性平均提高50倍。他們認為它可以很容易地擴展到這種基因編輯技術的不斷擴大的其他形式。這種方法給用于識別待編輯的DNA序列的向導RNA（gRNA）添加一條短尾巴。這條增加的尾巴折疊回來進行自我結合，從而產生一把僅由靶DNA序列打開的“鎖”。相關研究結果于2019年4月15日在線發表在Nature Biotechnology期刊上，論文標題為“Increasing the specificity of CRISPR systems with engineered RNA secondary structures”。

圖片來自Ella Maru。

　　論文通訊作者、杜克大學生物醫學工程副教授Charles Gersbach說，“CRISPR通常是非常準確的，但是也有一些例子表明存在脫靶活性，因此這一領域的廣泛興趣在于提高特異性。然而，到目前為止提出的解決方案不能在不同的CRISPR系統之間輕松轉換。”

　　CRISPR/Cas9是一種被細菌用來靶向切割入侵病毒的DNA的免疫防御系統。雖然第一個版本的經設計用于人體細胞的CRISPR技術源自一種名為釀膿鏈球菌的細菌，但是更多的細菌物種攜帶著其他的CRISPR形式。

　　這個領域的科學家們花了數年時間尋找具有所需特性的新CRISPR系統，并不斷將它們添加到CRISPR工具箱中。比如，一些CRISPR系統較小并且能夠更好地導入病毒載體中，從而被遞送到人細胞中用于基因治療。但無論每種CRISPR系統的基因編輯能力如何，所有的CRISPR系統都會時不時地產生不必要的基因編輯。

　　CRISPR系統的一個共同特性是它們使用RNA分子作為向導，靶向結合基因組中的特定DNA序列上。一旦gRNA找到它的互補性基因序列，Cas9酶就像剪刀一樣在DNA上進行切割，從而促進基因組序列發生變化。但是，鑒于每個gRNA序列僅有20個核苷酸長，而人類基因組含有大約30億個堿基對，因此需要進行大量的篩選，并且CRISPR有時會在一兩個堿基對不完美匹配的序列上進行錯誤地編輯。

　　一種提高CRISPR準確性的方法是需要兩個Cas9分子結合到相同DNA序列的相對兩側上，才能實現完整的切割。雖然這種方法有效，但是它會給CRISPR系統增加更多的組件，這會增加這種系統的復雜性并使得它更難以遞送到細胞中。

　　另一種方法是對Cas9蛋白進行基因改造而使得它不那么活躍，這樣它不太可能發生擦槍走火。雖然這也顯示出有希望的結果，但是這種類型的蛋白質工程是費力的，并且這種努力對于每個CRISPR系統是特異性的。

　　Gersbach說，“看起來幾乎每周都會發現一種新的CRISPR系統，每種系統具有某種獨特的性質，使得它對特定的應用非常有用。每當我們發現新的CRISPR蛋白時，對它進行廣泛的重新設計使得它具有更好的準確性并不是一種簡單的解決方案。”

　　論文第一作者、Gersbach實驗室博士生Dewran Kocak說，“我們專注于一種不會添加更多組件并且對任何類型的CRISPR系統都是通用的的解決方案。所有CRISPR系統的共同點是gRNA，而且這些短RNA更易于設計。”

　　Gersbach和Kocak的解決方案是將gRNA延長多達20個核苷酸，使得它折疊回來并與它自身的末端結合在一起，從而形成發夾形狀。這就產生了一種鎖，如果在仔細檢查可能遭受切割的DNA序列中，即使只有一個堿基對是錯誤的，它也很難被解鎖。不過，鑒于gRNA更喜歡與DNA而不是自身結合，與DNA的正確結合仍然能夠打開這種鎖。

　　Kocak說，“我們能夠對這種鎖的強度進行微調，使得gRNA在遇到正確匹配的DNA序列時仍能發揮作用。”

　　在這篇論文中，Kocak和Gersbach發現這種方法可以將來自四種不同細菌菌株的五種不同CRISPR系統對人體細胞的切割準確性提高平均50倍。在一種情形下，這種提高幅度上升到200多倍。

　　Gersbach說，“這是一種非常簡單的想法，盡管Dewran通過開展多年的研究來證實它的工作方式與我們想象的一樣。這是一個很好且優雅的解決方案，能夠除去脫靶活性。”

　　接下來，這些研究人員希望看到這種方法可以處理多少種不同的CRISPR變體，并對這種上鎖機制的工作原理進行深入的描述，以便觀察不同CRISPR變體之間是否存在差異。鑒于這些實驗是在體外培養的細胞中進行的，他們迫切希望看到這種方法在實際的動物疾病模型中如何可能提高CRISPR的準確性。