【原理】
RNA沉默是發生在植物（轉錄后基因沉默或共抑制）、動物（RNA干擾，RNAi）和真菌（消除作用）等真核生物細胞中的的特異性和高效率的mRNA降解機制。在哺乳動物細胞中，RNAi通常用于阻斷特定基因的表達從而研究基因的功能。將靶向特定基因的大約21堿基長短的雙鏈siRNAs(smallinterferingRNAs)，或者是45—50-mer的發夾結構RNA（smallhairpinRNA,shRNA）轉染到細胞。shRNA在細胞內會自動被加工成為siRNA，從而引發基因沉默或者表達抑制。通過質粒表達siRNAs同樣可以抑制特定基因的表達。選用PolIII啟動子啟動編碼shRNA(smallhairpinRNA)的序列。PolIII啟動子總是在離啟動子一個固定距離的位置開始轉錄合成RNA，遇到4—5個連續的U即終止，非常精確。當這種帶有PolIII啟動子和shRNA編碼序列的質粒轉染哺乳動物細胞時，這種能表達siRNA的質粒確實能夠下調特定基因的表達，抑制范圍包括外源基因和內源基因。
【試劑與儀器】
1．小牛血清。
2．雙抗溶液（鏈霉素100μg+青霉素100單位）。
3．DMEM培養基。
4．轉染試劑（LIPOFECTAMINE2000）。
5．細胞培養基（DMEM+10%NCS）。
6．PBS。
7．無血清培養基。
8．胰酶（Trypsin）。
9．培養皿，移液管，量筒，恒溫水浴箱，離心機，15ml離心管，微量移液器，熒光顯微鏡，連續光譜熒光酶標儀。
【操作步驟】
1.寡核苷酸單鏈的設計及合成
采用Ambion公司的siRNATargetFinder（onlinetargetfinder）進行siRNA的設計（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html），公司合成。
siRNATargetSequenceONE:5'-AAGGTGATGCTACATACGGAA-3'
SensesiRNAstrand:5'-GGUGAUGCUACAUACGGAAtt-3'
AntisensesiRNAstrand:3'-UUCCGUAUGUAGCAUCACCtt-5'
Positioningenesequence(cDNA):104
TopStrandOligonucleotideTemplate:(59mer)
5'-CGGTGATGCTACATACGGAATTCAAGAGATTCCGTATGTAGCATCACCTTTTTTGGTAC-3'
BottomStrandOligonucleotideTemplate:(59mer)
5'-CAAAAAAGGTGATGCTACATACGGAATCTCTTGAATTCCGTATGTAGCATCACCGGGCC-3'
2．shDNA的退火
用無核酶水稀釋合成的單鏈寡核苷酸至200μmol/L
反應體系組成：
TopstrandDNAoligo(R)（200μmol/L）5μl
BottomstrandDNAoligo(F)(200μmol/L)5μl
10×OligoAnnealingBuffer2μl
DNase/RNasefreewater8μl
Totalvolume20μl
程序退火
95℃4min變性
90℃、80℃、70℃、60℃、50℃、40℃、30℃、20℃、10℃每10度遞減，依次反應3min
4℃10min
-20℃保存
取1μl產物2%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定退火程度。
3．U6-shDNA質粒構建
用ApaI和KpnI雙酶切含人源U6啟動子的質粒，回收線性質粒（參見實驗一步驟9）。
用連接酶將步驟2退火片段與線性的載體連接。
在0.2ml或0.5ml反應管中加入下列成分
線性載體 50ng
shDNA100ng
T4連接酶2-3weissunits
10×連接緩沖液1μl
補超純水至總體積為10μl，常溫下放置30分鐘以上；也可以16℃或4℃過夜。
4．轉化細菌篩選陽性重組子（參見實驗四）。
5．擴增含陽性重組子的細菌，提取質粒，備用。
6．轉染細胞（參見實驗五）。
7．熒光顯微鏡觀察GFP的表達變化，用熒光酶標儀測熒光強度的變化。