icSHAPEMaP可探測完整的RNA結構

　　RNA的結構決定了它的生物功能，然而目前的RNA結構探測方法只能捕獲部分結構信息。測量完整（即全長）的RNA結構的能力將促進對小RNA的功能和調節機制的調查，并確定功能位點的短片段。

　　 2021年6月7日，來自清華大學張強鋒和斯坦福大學Mark A. Kay等研究團隊在Nature Communications上在線發表了題為“RNAstructure probing reveals the structural basis of Dicer binding and cleavage”的研究論文，提出了icSHAPE-MaP，一種結合體內選擇性2′-羥基酰化和突變分析的方法來探測完整的RNA結構。

　　硫酸二甲酯（DMS）、1-甲基-7-硝基異氰酸酐（1M7）、2-甲基煙酸咪唑化物（NAI-N3）和Kethoxal是廣泛用于體內RNA結構探測的試劑。DMS在體內修改單鏈區域內腺嘌呤和胞嘧啶堿基的N1和N3位置，而NAI-N3則對所有四個單鏈堿基的游離2′-羥基進行丙烯酸化，從而可以通過選擇性的2′-羥基酰化后的引物延伸（icSHAPE）對轉錄組進行體內結構探測。icSHAPE已被用于發現與不同生物過程相關的RNA的結構變化，如翻譯、RNA-蛋白質相互作用和活細胞中的N6-甲基腺苷修飾。

　　結構探測方法，包括DMS-seq和icSHAPE，測量在化學誘導的核苷酸修飾處產生的逆轉錄截斷，以確定一個核苷酸處于單鏈構象的概率。然而，一個限制是，由于短測序讀數的映射損失，探測目標的3′末端的結構信息將丟失。這個目標可能是一個完整的轉錄本或重點研究中的一個片段，例如一個長RNA的功能區。當應用這些方法對包括小RNA（sRNA，長度<~200 nt的RNA）或RNA結合蛋白（RBPs）的結合位點等尺寸較短的目標進行結構分析時，這一注意事項成為一個大問題。

　　為了克服這個3′末端脫落的問題，DMS-MaPseq和SHAPE-MaP測量逆轉錄過程中產生的突變率。然而，DMS-MaPseq提供部分核苷酸覆蓋（只能探測腺苷 "A "和胞苷 "C "核苷酸），目前的SHAPE-MaP試劑只有中等的細胞膜滲透能力，限制了它們在體內的使用。

　　Dicer屬于RNase III家族，可將雙鏈RNA（dsRNA）和pre-miRNAs分別裂解為成熟的小干擾RNA（siRNA）或miRNAs。成熟的miRNAs/siRNAs裝入Argonaute蛋白，形成RISC復合體，通過引導鏈和目標基因之間的Watson-Crick堿基配對，抑制目標基因的表達。Dicer如何精確地確定其在底物上的裂解位點對RNA干擾（RNAi）和miRNA生物生成具有核心意義。

　　研究提出，Dicer從dsRNA底物的3′或從5′端測量一定數量的核苷酸，以選擇pre-miRNA和dsRNAs。此外，對shRNAs和pre-miRNAs的體內研究表明，Dicer使用單鏈區域來精確錨定裂解位點的下游2-nt。然而，關于這些機制何時以及在多大程度上在pre-miRNA加工中運作，問題仍然存在。

　　此外，Dicer還與各種底物結合，但沒有明顯的經典miRNA或siRNA加工活動，這表明它在RNA代謝中還有其他作用。Dicer是否以及如何區分可裂解和不可裂解的底物尚不清楚。

　　在這項工作中，提出了一種在活細胞中探測完整RNA結構的方法。簡而言之，利用icSHAPE試劑和反轉錄中的突變分析的優勢，開發了一種結構探測方法，icSHAPE-MaP。為了證明其能力，使用icSHAPE-MaP來確定細胞sRNAs的完整結構信息。此外，我們將icSHAPE-MaP與RNA免疫沉淀（RIP）相結合，確定RNA內切酶Dicer底物的結構圖。通過結合icSHAPE-MaP和三級結構建模獲得的結構信息，發現空間距離測量是Dicer介導的前miRNA加工中的一個有影響力的參數。