摘要：優化的高效液相色譜法分析需要高純度溶劑和試劑。水質是非常重要的，它不僅是高效液相色譜法的一種溶劑，同時在樣品配置，標液和空白對照中起作用。大量實驗表明，中痕量有機物的水(用于流動相)存在可能影響高效液相色譜實驗結果。特別是在進行痕量級別的分析時，有機物可能會導致雜峰出現，基線漂移。柱效可能會阻塞，導致分辨率降低，峰拖尾。水中的有機物可能極大地影響液相色譜-質譜分析的結果。有機污染物易電離，就會與分析物結合，從而影響實驗結果。
本文主要研究在常規的高效液相色譜法分析下，使用新鮮制取的低總有機碳 (TOC)超純水的好處。低的總有機碳通過 UV 光氧化技術來實現從而達到含量小于 5 ppb 的 TOC 級別。高效液相色譜級瓶裝水和低 TOC 新鮮制取的超純水作為弱溶劑梯度洗脫，用乙腈作為強溶劑，分離七種藥劑混合物。重復多次實驗，進行初始和最終色譜性能比較。結果表明，隨著時間的推移，使用新鮮制取的低總有機碳 (TOC)超純水仍能很好的被色譜柱分離。通過 LC-MS 檢測不同 TOC 水平的水質處理的預濃縮水樣表現出來的效果不一樣。預濃縮的水被分析柱洗脫，紫外處理和質譜的數據顯示使用新鮮制取的低總有機碳 (TOC)的超純水能獲得更好的基線。
實驗方法:
藥劑的混合
以下按照色譜藥品標準來自 Alltech 濃度 1 毫克/毫升
在甲醇溶解: 對乙酰氨基酚、 乙酰唑胺 、卡馬西平、苯巴比妥 、苯妥英、萘丁美酮和速可。混合物制備每種藥品含 0.200 μ g/m l 。
流動相
水和乙腈作為流動相。水有兩個來源: HPLC 級瓶裝水(Fisher) 和 Milli-Q Gradient A10 (Millipore)并通過0.22 微米的 Millipak ?所制造的新鮮水。乙腈是高效液相色譜級(Fisher)。
儀器：高效液相色譜系統: Waters 510 HPLC 色譜泵；717 加自動進樣器；9966 光電二極管陣列，設置在190-400 毫微米的探測器；列: SymmetryShield RP18 (Waters), 3.5 μ m，4.6 x 150 毫米。
程序
25 μ L 注射藥物混合通過 0.45 μ m 13 毫米 Millex ?-LCR 過濾裝置過濾。
按照以下的梯度洗脫 (水: 乙腈)
組分的混合物的分離:
80%至 30%水的 15 分鐘
30%至 80%水 1 分鐘，再進行 80%水 4 分鐘
兩種不同類型的水作為流動相
純化鏈:
結果和討論:
圖 1：在 214 nm，流動相分別為(A) 高效液相色譜級水、 (B) 與 TOC< 5 ppb 超純水圖譜 1-對乙酰氨基酚、 2-乙酰唑胺、 3-苯巴比妥、 4-卡馬西平，5-苯妥英、 6-速可，7-萘丁美酮
圖 2：在 254 nm，流動相分別為(A) 高效液相色譜級水、 (B) 與 TOC< 5 ppb 超純水圖譜。請注意在圖譜 A 顯示的雜峰
圖 3：. 使用相同藥物混合物在重復注射 780 次后峰面積變化。
圖 4：(A) 水有無紫外燈氧化的圖譜對比。(B) 無紫外燈氧化水在 13.1 分鐘質譜圖譜 (TOC = 12 ppb)。
(C) 紫外燈處理的水(TOC = 4 ppb)在 13.1 分鐘質譜圖譜
高效液相色譜法通常建議使用 HPLC 級瓶裝水為流動相的制備。這種類型的水被證明有低紫外線吸收度和能釋放離子。因此，這種規格的水含有一定的有機雜質。這種雜質會影響高效液相色譜法分析，尤其是在梯度洗脫。有機雜質將色譜填料結合，色譜被洗脫最終出現雜峰。這就會給色譜分離帶來困難或錯誤。此外，這些雜質會導致基線升高，降低靈敏度。采用雙波長 [185 + 254 nm] UV 燈能生成羥基自由基(OH) (方案 A)氧化有機分子，有效降低 TOC 到低 ppb 水平 (通常 < 5 ppb)。最終產物有機酸是經過紫外燈再由混合離子交換樹脂接留下來的。
此次研究，將高效液相色譜級瓶裝水和 TOC<5 ppb 新鮮制取的超純水作為洗脫劑對 7 種藥物混合物(數字 1-3) 高效液相色譜法分離比較。混合物被反復注射，對第 50 和 1310 次 注射圖譜進行了比較。圖1 和圖 2 分別 是 214 nm 和 254 nm 圖譜，顯然，在進行 1260 次重復實驗后，使用低 TOC 新鮮制取的超純水比高效液相色譜級瓶裝水基線更穩定。在同樣的重復注射后，高效液相色譜級瓶裝水顯示基線往正方向漂移。在圖 2A，在重復注射第 1310 次的 HPLC 級瓶裝水約 5 分鐘后出現雜峰。這可能是由于有機物污染物結合到色譜填料上被洗脫下來。圖 2B 使用了超純水并沒有出現雜峰。圖 3 對比之間第 50 和1310 次注射色譜峰的峰面積的變化。當采用超純水，峰面積的變化較少。圖 4 LC-MS 數據表明紫外燈氧化能降低純水中的有機污染物。185/254 nm UV 燈被關閉時，會出現若干雜峰 (圖 4A，藍色標記)。圖4B 顯示在 13.1 分鐘出現的峰值最大。圖 4B 顯示在 13.1 分鐘峰的質譜圖， m/z 279 是峰值最高的。當UV 燈打開后，這個峰值顯著降低。 (圖 4A 中的粉紅色標記，質譜在圖 4)。
結論:
TOC<5 ppb 新鮮制取的超純水作為流動相進行 HPLC 分析能避免雜峰的出現，有助于明確識別的峰外
觀，更重要的是在定量分析研究中是必不可少的。
? 使用這種高質量水的基線漂移最小化。
?通過 UV 燈氧化處理得到低 TOC 超純水可以獲得高效率的前處理系統
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