目前，世界范圍內育齡期夫婦不孕不育的比例約為8-12%，其中男性因素所致約占50%， 而精子生成異常是導致男性不育癥的主要遺傳因素之一【1】。精子生成是未成熟精子細胞經歷頂體形成等一系列細胞形態重塑事件，最終分化為具備運動能力和受精潛能成熟精子的過程【2】。位于精子頭部前段的頂體是精子特化的囊泡樣細胞器，其內含有的多種蛋白水解酶可協助精子穿越卵子透明帶，在精卵融合過程中發揮重要作用【3】。頂體的正確組裝依賴于細胞骨架系統介導的前頂體囊泡協同運輸及囊泡融合，研究此過程涉及的分子事件及調控機制對臨床男性不育癥病因的解析具有重要的意義。
微絲骨架（Filamentous actin, F-actin）在有絲分裂、遷移以及分化等細胞生命活動中發揮著重要作用。正常的微絲空間結構是維持微絲骨架生理功能的基礎，其形成主要依賴于微絲結合蛋白（actin-binding proteins）參與介導的微絲骨架動態重塑【4】。絲切蛋白（COFILIN）是一類負責特異性解聚絲狀肌動蛋白的微絲結合蛋白，其活性主要受其自身Ser-3位點磷酸化修飾狀態影響，絲切蛋白磷酸酶家族（Slingshot phosphatase family, SSHs）作為目前已知少有的絲切蛋白特異性磷酸酶，此前被報道在腫瘤侵襲遷移中發揮了重要作用，但SSHs在雄性配子發生過程中的生物學功能仍不清楚。
2023年3月21日，山東大學生殖醫學研究中心陳子江/劉洪彬團隊在eLife上發表了題為 The Slingshot phosphatase 2 is required for acrosome biogenesis during spermatogenesis in mice 的研究論文。該研究基于Ssh2基因敲除小鼠模型以及SSH2標簽小鼠模型，揭示了SSH2在精子生成過程中參與調控頂體形成的生物學功能。
此前，已有組織學研究結果顯示SSH2蛋白在小鼠睪丸中呈高表達【5】。為了探究SSH2在雄性配子發生過程中的作用，研究團隊采用基因編輯技術分別構建了Ssh2基因敲除小鼠以及攜帶血凝素（hemagglutinin, HA）蛋白標簽的SSH2-HA標簽小鼠，發現雄性敲除小鼠表現為不育，睪丸內未見除圓形精子外的精子細胞，雌性敲除小鼠生育力未見明顯異常。通過進一步組織學分析，研究人員確定Ssh2敲除后精子生成過程被阻滯在Ⅱ-Ⅲ期，精子細胞發育終止于早期step 1–3圓形精子階段，曲細精管腔可見數量增多的凋亡樣細胞。為了尋找Ssh2敲除鼠生精阻滯的具體原因，研究人員首先利用TUNEL染色結果證實Ssh2敲除鼠曲細精管和附睪內凋亡生殖細胞數量顯著增加，同時伴有睪丸內凋亡信號分子如BAX、Caspase-3等的異常表達，提示Ssh2敲除會導致精子細胞凋亡。
通過睪丸壓片技術觀察花生凝集素（peanut agglutinin，PNA）標記的精子細胞，研究人員進一步確認敲除鼠的頂體形成過程受阻于Golgi期，并觀察到Ssh2?/?精子細胞中散在分布的頂體碎片。利用透射電鏡技術，研究人員發現Ssh2?/?圓形精子內前頂體囊泡不能融合形成一個完整的頂體泡，伴有高爾基體堆增厚。隨后研究人員檢測高爾基體標志蛋白GM130（在維持高爾基體結構穩定性及囊泡運輸中發揮重要作用）發現Ssh2?/?精子細胞胞質內GM130熒光信號異常聚集，這些結果表明SSH2在精子細胞頂體形成過程中發揮了重要作用（圖1）。隨后，研究人員觀察了不同發育階段小鼠SSH2表達譜，發現其在睪丸內的表達自PD21起顯著升高，提示其可能參與了圓形精子發育過程。SSH2主要定位于精母細胞及圓形精子胞質，在圓形精子內SSH2顯著富集于PNA標記的頂體區域。此外，研究人員還利用SSH2-HA標簽小鼠證實了SSH2在頂體形成過程中的動態性表達。以上結果表明SSH2與頂體形成的功能相關性。
研究人員隨后對SSH2參與精子細胞頂體形成的機制進行探究，發現生殖細胞內F-actin結構受Ssh2敲除影響而改變，Ssh2?/?生殖細胞內聚集有大量團塊狀FITC-phalloidin信號，睪丸壓片結果表明Ssh2敲除后F-actin傾向自發聚合，且其胞內定位與頂體結構的分布無關，暗示Ssh2敲除擾亂了精子細胞內F-actin的結構重塑過程。此外，研究人員發現Ssh2敲除改變了精子細胞中囊泡運輸/融合相關蛋白GOPC以及LC3在頂體區域的定位模式，提示SSH2在前頂體囊泡運輸/融合過程中發揮了關鍵作用。Ssh2?/?睪丸蛋白中檢測到顯著升高的磷酸化狀態COFILIN及過表達的F-ACTIN，睪丸切片中P-COFILIN熒光強度明顯增強，并發現Ssh2?/?精子細胞中同時出現的聚集樣F-actin結構及胞內廣泛分布的P-COFILIN。由此，證實SSH2通過維持COFILIN磷酸化平衡參與微絲結構重塑，進而在頂體形成過程中發揮了重要調控性作用。
近年來，微絲系統被發現作為骨架平臺參與高爾基體與新生頂體間的物質運輸，但對這一生物學過程涉及的分子機制仍知之甚少。此項研究鑒定了Slingshot家族成員SSH2是頂體形成事件的一個關鍵調控因子，并闡明了SSH2通過直接調控COFILIN磷酸化水平，參與微絲結構重塑，進而影響精子細胞內前頂體囊泡運輸/融合過程的分子機制，進一步展示出微絲結構的可塑性及其動態調控在頂體形成過程中發揮的獨特作用，也為解析不育癥的致病機制提供了新思路 (圖2）。
山東大學陳子江院士、劉洪彬教授和香港中文大學-山東大學生殖遺傳聯合實驗室路鋼教授為共同通訊作者，山東大學許珂博士生、蘇獻偉博士和中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心方凱倫博士后為該文章的共同第一作者。
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https://doi.org/10.7554/eLife.83129