克隆化酵母DNA的操作實驗——質粒缺口修復
實驗材料酵母實驗步驟1. 將目的基因亞克隆到YRp質粒，通過基因內的兩個限制性位點在基因中創造一個缺口區，在缺口兩側留下≥100~250 bp 的同源區，凝膠電泳純化質粒骨架大片段。 2. 用1~10 μg 缺口質粒DNA轉化待拯救的含突變等位基因的酵母菌株，通過YRp質粒上的選擇基因進行選擇，應用質粒分離除去技術鑒定選擇標志不穩定的轉化子。 3. 在不穩定的轉化子中，篩選那些仍然顯示突變表型的轉化子。 4. 從帶突變表型的轉化子中制備DNA轉化大腸桿菌，分析小量制備的DNA。展......閱讀全文
克隆化酵母DNA的操作實驗——質粒缺口修復
實驗材料酵母實驗步驟1. ?將目的基因亞克隆到YRp質粒，通過基因內的兩個限制性位點在基因中創造一個缺口區，在缺口兩側留下≥100~250 bp 的同源區，凝膠電泳純化質粒骨架大片段。?2. ?用1~10 μg?缺口質粒DNA轉化待拯救的含突變等位基因的酵母菌株，通過YRp質粒上的選擇基因進行選擇，
克隆化酵母DNA的操作實驗——穿梭質粒
實驗材料酵母實驗步驟1. ?構建其必需基因的染色體拷貝已被破壞的單倍體菌株，及帶有完整的必需基因和URA3選擇標志的YEp質粒。2. ?將必需基因亞克隆到YCp載體（帶有URA3以外的選擇標志），取約10~20 μg 用羥胺或其他技術進行誘變。3. ?轉化至步驟1的菌株中，在添加了尿嘧啶的省卻成分平
克隆化酵母DNA的操作實驗
實驗材料?酵母實驗步驟 ? 將待研究的基因亞克隆到YIP質粒。2.? 用限制性內切酶在克隆化基因內部切開，使質粒線性化。3.? 用1~10 μg DNA加上擔體DNA轉化適合的菌株，通過質粒上帶的標記進行選擇，在選擇培養基上純化幾個轉化子，制備DNA，應用Southern 雜交確證整合是否發生在所期
克隆化酵母DNA的操作實驗——基因置換技術
實驗材料酵母實驗步驟一、整合性破壞1. ?將基因的內部片段亞克隆到YIP載體。2. ?在此內部片段中將質粒線性化。3. ?繼續整合性轉化步驟3（見基本方案1）。二、基因破壞一步法1. ?將合適的選擇性基因亞克隆到目的基因上，必要時，可在亞克隆的同時引入一個缺失。2. ?采用合適的限制性位點，從步驟1
克隆化酵母DNA的操作實驗——整合性轉化
實驗材料酵母實驗步驟1. ?將待研究的基因亞克隆到YIP質粒。?2. ?用限制性內切酶在克隆化基因內部切開，使質粒線性化。?3. ?用1~10 μg DNA加上擔體DNA轉化適合的菌株，通過質粒上帶的標記進行選擇，在選擇培養基上純化幾個轉化子，制備DNA，應用Southern 雜交確證整合是否發生在
酵母質粒提取離心法操作步驟
酵母質粒提取離心法操作步驟：1.接種5 mL含有酵母攜帶所需質粒的YDP培養液，將其振蕩培養在30℃16-24小時。2.取1-3ml酵母培養菌體(使用< 2×107細胞)，室溫下5000× g離心5 min。3.棄培養液，收集菌體，加入480μL Buffer SE和30μL Lyticase so
酵母細胞中質粒的加工實驗
定位突變質粒缺口修復技術和等位基因修復技術實驗材料酵母菌株試劑、試劑盒帶選擇標記的YRp或YCp質粒適當的限制性內切核酸酶相應選擇標記突變的酵母菌質粒標記的選擇培養基平板儀器、耗材培養皿實驗步驟1）將目的基因亞克隆到帶恰當的選擇標記的YRp或YCp質粒上。2) 在基因內部的兩個限制酶酶切位點上切割以
酵母細胞中質粒的加工實驗_穿梭質粒
實驗材料帶有一個非URA3選擇標記YCp載體試劑、試劑盒缺失成分平板+Ura含有5-FOAYCp質粒選擇性培養基的平板YPD平板YIP5載體儀器、耗材培養皿實驗步驟1) 構建染色體上重要基因被破壞的單倍體菌株以及含有完整重要基因和URA3選擇標 記的YEp或YCp質粒。2) 對于誘發突變，將重要基因
酵母細胞中質粒的加工實驗——從酵母細胞中分離質粒
利用一個假定的突變通過互補作用克隆酵母菌基因的一般方法。該突變為cdc101-1，它對酵母菌的生長來說既是隱性的又是溫度敏感的。它使酵母可以很正常地在30°C生長，而不能在37°C形成菌落。如果用一個酵母菌基因組文庫轉化cdc101-1菌株，通過分離溫度不敏感菌落，那么就可能分離到一個可以互補這種突
質粒DNA提取實驗
實驗方法原理?質粒多為一些雙鏈、環狀的DNA分子，是獨立于細菌染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。質粒是進行分子生物學實驗操作，進行遺傳工程改良物種等工作時最主要的DNA載體。?提取質粒的基本步驟分為三步：①細菌的培養和質粒的擴增②細菌菌體的裂解③質粒DNA的純化實驗材料?大腸桿菌試劑、試劑盒
質粒DNA提取實驗
堿解法SDS堿裂解法（試劑盒提取）實驗方法原理堿裂解法是基于DNA的變性與復性差異而達到分離目的的。堿性使質粒DNA變性，再將pH值調至中性使其復性，復性的為質粒DNA，而染色體DNA不會復性，纏結成網狀物質，通過離心除去。實驗材料大腸桿菌 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
質粒DNA提取實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 堿裂解法是基于DNA的變性與復性差異而達到分離目的的。堿性使質粒DNA變性，再將pH值調至中性使其復性，復性的為質粒DNA，而染色體DNA不會復性，纏結成網狀物質，通過離心除去。
質粒－DNA－的轉化實驗
實驗方法原理轉化活性是檢測質粒生物活性的重要指標，在基因克隆技術中，轉化（transformation）是特指以質粒 DNA 或以它為載體構建的重組質粒 DNA（包括人工染色體）導入細胞的過程， 是一種常用的基本實驗技術。 該過程的關鍵是受體細胞的遺傳學特性及其所處的生理狀態，用于轉化的受體細胞一般
質粒－DNA－的轉化實驗
實驗方法原理 轉化活性是檢測質粒生物活性的重要指標，在基因克隆技術中，轉化（transformation）是特指以質粒 DNA 或以它為載體構建的重組質粒 DNA（包括人工染色體）導入細胞的過程， 是一種常用的基本實驗技術。 該過程的關鍵是受體細胞的遺傳學特性及其所處的生理狀態，用于轉化的受
酵母細胞質粒分離實驗
在非選擇性生長條件下，大多數大腸桿菌/酵母菌穿梭載體的丟失頻率大約1%，采用本方案不易分離除去的一個質粒是內源性2 μm 質粒，2 μm DNA自發丟失的頻率約為每代10-4。實驗材料酵母試劑、試劑盒YPD儀器、耗材接種針培養瓶搖床實驗步驟1. ?挑取幾個含質粒的酵母宿主菌菌落，接種于10 ml 非
酵母細胞質粒分離實驗
實驗材料 酵母試劑、試劑盒 YPD儀器、耗材 接種針培養瓶搖床實驗步驟 1. ?挑取幾個含質粒的酵母宿主菌菌落，接種于10 ml 非選擇性培養基，于30℃培養過夜。 2. ?在非選擇性平板上于30℃培養2天以得到單菌落，大多數情況下，可以得到約200~300個單菌落（約每平板100個菌落）。 3.
酵母細胞中質粒的加工實驗
實驗方法原理 在非選擇性生長條件下，大多數大腸桿菌/酵母菌穿梭載體的丟失頻率大約1%。 在本方案中含質粒的酵母菌株接種于非選擇性平板上以分離質粒并可得到單菌落。然后通過影印到選擇性平板上可以鑒別丟失了質粒的菌株實驗材料 含質粒的酵母菌株試劑、試劑盒 YPD或其他非選擇性液體培養基及平板CM缺失成分
質粒DNA大量制備實驗
實驗方法原理?這一方案科能是最常用的質粒制備方法，該法不僅相當決捷可靠，而且可獲得相當純凈的粗制DNA。實驗材料?大腸桿菌試劑、試劑盒?葡萄糖TrisEDTATENaOHSDS異丙醇乙醇乙酸甲儀器、耗材?離心機漩渦混合器水浴鍋實驗步驟?1.? 往2 ml 燒瓶中加入500 ml ，含有適當抗生素的L
質粒DNA大量制備實驗
堿裂解法 平衡離心法 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 這一方案科能是最常用的質粒制備方法，該法不僅相當決捷可靠，而且可獲得相當純凈的粗制DNA。
耐藥質粒－DNA轉化實驗
耐藥質粒 DNA轉化實驗 本實驗學習將質粒DNA分子轉入大腸桿菌的方法及如何篩選帶有質粒DNA的細胞克隆，即轉化子。 【原理】 受體菌Ecoli RRI 在低溫條件下經Ca++ 處理，可改變細胞膜的通透性，利于受體菌對DNA的攝取，這種經Ca++ 處理的細菌稱感受態菌。pBR322 質粒
質粒DNA提取實驗步驟
質粒DNA提取可以：(1)快速純化質粒;(2)用于測序、體外轉錄與翻譯、限制性內切酶消化、細菌轉化等分子生物學實驗。實驗方法原理質粒多為一些雙鏈、環狀的DNA分子，是獨立于細菌染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。質粒是進行分子生物學實驗操作，進行遺傳工程改良物種等工作時最主要的DNA載體。
質粒DNA的小量制備實驗
實驗方法原理 堿裂解法是最常用的小量制備質粒DNA的方法。實驗材料 培養基試劑、試劑盒 EDTASDS乙醇VTE儀器、耗材 平板實驗步驟 1. ?接種一個單菌落于5 ml無菌LB培養液中，在37°C培養至飽和狀態（過夜）。2. ?取1.5 ml培養液以最大轉速離心20 S。棄上清。3. ?沉淀用10
質粒DNA的小量制備實驗——
實驗采用國產的質粒小量抽提試劑盒。它是一種新型的離子交換柱，在特定的條件下，使質粒能在離心過柱的瞬間，結合到質粒純化柱上，在一定條件下又能將質粒充分洗脫，從而實現質粒的快速純化。實驗材料DNA試劑、試劑盒LB培養基卵清溶菌酶異丙醇TE儀器、耗材離心機漩渦混合器水浴鍋實驗步驟一、實驗步驟1. ?接種一
質粒DNA的小量制備實驗
實驗方法原理 當菌體在NaOH和 SDS溶液中裂解時，蛋白質與DNA發生變性，當加入中和液后，質粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態，離心時留在上清中；蛋白質與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。堿裂解法是最常用的小量制備質粒DNA的方法。實驗材料 細菌克隆試劑、試劑盒 LB培養基抗生素葡
質粒DNA的大量制備實驗
堿裂解法 氯化銫/溴化乙錠平衡離心法 層析法 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 大量堿裂解方法不僅相當快捷可靠，而且可獲得相當純凈的粗制DNA。煮沸法的大量制
質粒DNA的大量制備實驗
實驗方法原理 大量堿裂解方法不僅相當快捷可靠，而且可獲得相當純凈的粗制DNA。煮沸法的大量制備也簡單易行，但得到的DNA比較粗制。高純度的質粒DNA可通過氯化銫/溴化乙錠平衡離心法或層析法進一步純化粗制DNA得到。實驗材料 培養基菌株試劑、試劑盒 EDTASDS乙醇乙酸鉀異丙醇儀器、耗材 離心管實驗
質粒DNA的小量制備實驗
堿裂解小量制備法 煮沸法 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 DNA 試劑、試劑盒
酵母遺傳學方法4：質粒DNA的羥基突變
質粒DNA的羥基突變1．臨用之前制備羥胺溶液，置冰上待用。2．將用氯化銫純化的10μg質粒DNA加到含500μl羥胺溶液的微型離心管。3．在37℃下培養20小時。4．加入10μl的5mol/L NaCl、50μg 1mg/ml的牛血清蛋白（BSA）和1ml無水乙醇終止反應，置－70℃沉淀DNA10分
細菌質粒－DNA－的小量制備實驗
細菌質粒的發現是微生物學對現代分子生物學發展的重要貢獻之一。特別是自 70 年代末以來，根據質粒分子生物學特性而構建的一系列克隆和表達載體更是現代分子生物學發展、改良生物品種和獲得基因工程產品不可缺少的分子載體，發展十分迅速，而質粒的分離和提取則是最常用和最基本的實驗技術，其方法很多。僅大腸桿菌質粒
質粒DNA導入細菌細胞實驗
CaCl2轉化法 一步法制備和轉化感受態細菌實驗 電轉化法 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 菌落 質粒DNA