酵母遺傳學方法3：RNA的分離
酵母RNA的分離1）總酵母RNA的分離1．在每毫升培養物中加入50μg環乙酰亞胺，在30℃下振蕩15分鐘。此步亦可省略，但是有人認為環乙酰亞胺可防止mRNA凝集在多核糖體上。2．迅速冷凍收集細胞，在大離心管中加入約一半體積的碎冰，將培養物倒入，振蕩，在4℃下以5000r/min離心5分鐘。3．加入11g玻珠于30ml離心管中，以Corex玻璃離心管為最佳，不過塑料離心管也能使用。4．加入3ml已用LETS緩沖液平衡的苯酚到玻珠中。LETS緩沖液：0.1 mol/L 氯化鋰0.01 mol/L Na2EDTA0.01 mol/L Tris-HCl (pH7.4)0.2% SDS0.1% 二乙基焦碳酸（可任選）5．用2.5ml冰預冷的LETS緩沖液懸浮細胞，并將其加入到上述玻珠苯酚管中。為了使細胞破碎的最好，液面應剛好高于玻珠表面。6．高速振蕩30秒后，在冰上置30秒，......閱讀全文
酵母遺傳學方法3：RNA的分離
酵母RNA的分離1）總酵母RNA的分離1．在每毫升培養物中加入50μg環乙酰亞胺，在30℃下振蕩15分鐘。此步亦可省略，但是有人認為環乙酰亞胺可防止mRNA凝集在多核糖體上。2．迅速冷凍收集細胞，在大離心管中加入約一半體積的碎冰，將培養物倒入，振蕩，在4℃下以5000r/min離心5分鐘。3．加入1
酵母遺傳學方法1：DNA分離
酵母DNA分離1）酵母DNA微量制備（40ml）1．在125ml三角瓶中用40ml YPD培養液在30℃條件下培養細胞達最大生長量（過夜）。2．將上述培養物移入螺蓋離心管，用醫用離心機或Sorvall SS－34轉頭以5000r/min離心5分鐘，棄去上清液。3．將細胞懸浮在3ml的0.9mol/L
酵母RNA提取與分離
一、目的：學習稀堿法提RNA的原理與技術。二、原理：由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也各異，一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法又是實驗室最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質則留在酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析
酵母遺傳學方法實驗指南——技術和方案3
技術和方案3 酵母 DNA 分離實驗材料質粒DNA玻璃珠試劑、試劑盒YPD消解酶 100TTris-HClSDS乙酸鉀TE 緩沖液RNaseA 溶液山梨醇無水異丙醇裂解緩沖液儀器、耗材三角瓶離心管實驗步驟一、酵母 DNA 微量制備（40 ml)1.在 125 ml 三角瓶中用 40 mlYPD 培養
酵母遺傳學方法8：酵母活體染色
酵母活體染色1）核DNA和線粒體DNA1．當細胞培養到約107細胞/ml時，離心（5秒）收集細胞，再懸浮在70％乙醇中。2．固定5分鐘或5分鐘以上，用水洗2次。3．將細胞懸浮在含有50ng/ml的4，6-二脒基-2苯基吲哚的封固劑中。1mg/ml的4，6-二脒基-2苯基吲哚母液可在－20℃下貯存。4
酵母遺傳學方法12：酵母菌落PCR方法
酵母菌落PCR方法1．在冰上配制反應混合液：2μl??????????????????10×菌落PCR緩沖液1.2μl?????????????????25mmol/L MgCl20.4μl?????????????????10mmol/L dNTPs10pmol????????????????引物
酵母遺傳學方法9：酵母免疫熒光
酵母免疫熒光1）細胞制備1．培養5ml酵母至對數生長早期（106～107細胞/ml）。2．直接加1/10體積的甲醛到培養基里固定細胞（加入的甲醛終濃度為3.7％，標準母液是37％）。3．細胞在甲醛中培養至少1小時。4．離心收集細胞，用0.1mol/L磷酸鉀（pH7.5）洗一次。5．把細胞懸浮在1ml
酵母遺傳學方法5：酵母β－半乳糖苷酶的測定
酵母β－半乳糖苷酶的測定1）??粗提取物測定1．在適當溫度下（通常30℃），用適當培養液將5ml細胞培養物培養到濃度為1×107～2×107細胞/ml。如果自主復制質粒的雜合基因表達，可使用一種適當培養基對存在質粒的菌株進行篩選。2．在冰上冷卻細胞，離心收集。注意：以下步驟保持細胞在冰上。3．棄上清
酵母遺傳學方法7：隨機孢子分析
隨機孢子分析1）孢子形成1．挑已形成孢子的二倍體單菌落接種在YPD平板上，盡可能把細胞涂薄一些，在30℃下培養12～16小時，超過16小時將明顯降低孢子的形成率。2．上午，用一個無菌殼板釘取相當一火柴頭量的細胞，轉到含有2.5ml產孢培養基試管中，在25℃下旋轉振蕩培養。3．用光學顯微鏡檢測孢子形成
酵母遺傳學技術
Genome-wide Gene Expression Analysis?(Richard Young Research Group,Whitehead Institute for Biomedical Research)A genoe-wide gene expression analysis u
RNA的制備(mRNA的分離和RNA酶活性的控制)3
A、細胞裂解a．單層細胞的裂解a)吸出培養液，以7ml用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液PBS沖洗細胞培養皿內的單層細胞，重復1次，將平板置于冰上直至所有單層細胞沖洗完畢。也可將平板放在一塊鋁板上，再將鋁板置于冰盤上。b)直徑為90mm的培養皿需加0.5ml RNA提取緩沖液， 并使之遍布整個平板的
酵母遺傳學方法4：質粒DNA的羥基突變
質粒DNA的羥基突變1．臨用之前制備羥胺溶液，置冰上待用。2．將用氯化銫純化的10μg質粒DNA加到含500μl羥胺溶液的微型離心管。3．在37℃下培養20小時。4．加入10μl的5mol/L NaCl、50μg 1mg/ml的牛血清蛋白（BSA）和1ml無水乙醇終止反應，置－70℃沉淀DNA10分
酵母遺傳學方法實驗指南——技術和方案
技術和方案6 酵母 RNA 的分離試劑、試劑盒環乙酰亞胺苯酚LETS緩沖液LiCl乙醇SDS乙酸鈉AE 緩沖液儀器、耗材大離心瓶玻璃珠離心管oligo (dT) 柱實驗步驟大量 RNA 分離程序酵母總 RNA 的分離1.在每毫升培養物中加入 50ug 環乙酰亞胺，在 30°C 下搖晃 15 min。
酵母總RNA的制備
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 AE 緩沖液。 ? 苯酚 10%SDS ?酚 ?氯仿 ? 無水乙醇 乙醇. ?3mol L 乙酸鈉 ?無 RNase
酵母總RNA的制備
試劑、試劑盒 AE 緩沖液。 苯酚 10%SDS 酚 氯仿 無水乙醇 乙醇. 3mol L 乙酸鈉 無 RNase 的水儀器、耗材 髙速離心機實驗步驟 一 材料與設備1)AE 緩沖液：50 mmol/L 乙酸鈉 (PH5.3)，lOmmol/LEDTA。2) 苯酚 (用 AE 緩沖液預先平衡）。3)
植物RNA的分離（總RNA的分離和mRNA的分離）
1. 總RNA的分離總RNA分離的方法很多，常采用的是異硫氰酸胍和b-巰基乙醇這兩種RNase 抑制劑來抑制RNase的活性，同時，異硫氰酸胍與十二烷基肌氨酸鈉（sarcosyl）共同作用可以破壞核蛋白復合體，使RNA順利地解脫出來溶進緩沖液。由于RNA在堿性條件下不穩定，因而在整個提取過程中體
RNA實驗方法3
Part III: HybridizationTurn heatblock on to 95C.For samples in water or ethanol, dry down appropriate amount of RNA, and include a tube with 1ul of tR
RNA分離與分析實驗_分離RNA
實驗材料標記細胞試劑、試劑盒乙酸緩沖液儀器、耗材漩渦器實驗步驟1. 收獲標記細胞。2. 小心處置上清液，用含 0.3% SDS 的 10 mmol/L 乙酸緩沖液懸浮細胞沉淀，每 1 ml 壓積細胞用 10 ml 緩沖液。3. 于室溫用漩渦器振蕩裂解細胞。4. 加等體積的水飽和酚，充分混勻，于 60
酵母遺傳學方法6：羧肽酶Y的平板鑒定
羧肽酶Y的平板鑒定1．在YPD平板上培養菌落和菌苔（通常菌落長3天，菌苔長1天即可）。2．小心把涂蓋液加在平板的表面使之完全覆蓋細胞。3．待瓊脂凝固5～10分鐘后，小心用新鮮Fast Garnet GBC溶液沖刷表面。4．顯色5分鐘，野生型菌株將變紅，而羧肽酶Y－菌株將呈現黃色或粉紅色。5．倒出Fa
酵母遺傳學方法2：蛋白質的抽提
酵母蛋白質的抽提此法抽提的酵母蛋白適用于SDS凝膠電泳和Western印跡分析。1．從OD600＝2的細胞培養物中抽提酵母蛋白質。培養物的一種簡單制備方法是將細胞接種到5ml YPD中，過夜培養后獲得指數培養物（OD600＝0.5～2.0）。2．在水浴上把OD600＝2的細胞培養物轉到含有2ml的5
酵母遺傳學方法實驗指南——技術和方案2
技術和方案2 快速粗放的酵母菌落質粒轉化法實驗步驟展
酵母遺傳學方法實驗指南——技術和方案1
技術和方案1 酵母的高效轉化實驗步驟展開
酵母遺傳學方法實驗指南——技術和方案4
技術和方案4 酵母蛋白質的抽提試劑、試劑盒NaOHPAGE 樣品緩沖液Tris-HCl甘油β-巰基乙醇溴酚藍實驗步驟1.從液體培養物中或用細菌接種環在平板表面刮菌，收集大約 2.5 OD的細胞量（大約 2.3 mg 濕重）。將細胞重懸于 100ul 蒸餾水中，加入 100ul O.2mol/L Na
酵母遺傳學方法實驗指南——技術和方案7
技術和方案7 質粒 DNA 的羥胺突變試劑、試劑盒羥胺溶液氯化銫純化的質粒DNANaCl牛血清白蛋白無水乙醇TE 緩沖液實驗步驟1.臨用之前制備羥胺溶液，置冰上待用。2.將用 CsCl 純化的 10 埤質粒 DNA 加到含 500ul 羥胺溶液的微量離心管中。3.在 37°C 下溫育 20 h。4.
酵母遺傳學方法實驗指南——技術和方案5
技術和方案5 TAP純化方法試劑、試劑盒NP-40緩沖液TEV C 緩沖溶液鈣調蛋白結合緩沖液（CBB)鈣調蛋白洗脫緩沖液（CEB)實驗步驟1.培養 3~6L 細胞至濃度為 2X107~3X107 個/ml(OD50=1.0~1.3)。2.離心收集細胞，并用冰預冷的水洗一次。3.用冰預冷的 NP-4
酵母遺傳學方法11：PCR介導基因破壞法
PCR介導基因破壞法1．反應混合物：5μl?????????????10×Taq緩沖液5μl?????????????25mmol/L MgCl22μl?????????????10mmol/L dNTPs10~100ng?????????模板DNA25pmols??????????引物（每種引物）
酵母DNA的快速分離
實驗方法原理 根據該方案制備的酵母 DNA 可以用作 PCR 反應的模板。在 E. coli 和 Saccharomyces cerevisiae 中均能復制的穿梭質粒也可以從酵母中提取，并且可以用于轉化 E. coli。實驗材料 酵母細胞試劑、試劑盒 乙醇酚氯仿醋酸鈉STES 緩沖液TE儀器、耗材
酵母DNA的快速分離
根據該方案制備的酵母 DNA 可以用作 PCR 反應的模板。在 E. coli 和 Saccharomyces cerevisiae 中均能復制的穿梭質粒也可以從酵母中提取，并且可以用于轉化 E. coli。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。實驗方法原理根據該方案制備的酵母 DNA 可
酵母DNA的快速分離
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 根據該方案制備的酵母 DNA 可以用作 PCR 反應的模板。在 E. coli 和 Saccharomyces cerevisiae 中均能復制的穿梭質粒也可以從酵母中提取，并且可以用于轉化 E. coli。
2.5.1－酵母總RNA的制備
試劑、試劑盒AE 緩沖液。 苯酚10%SDS酚氯仿 無水乙醇乙醇. 3mol L 乙酸鈉無 RNase 的水儀器、耗材髙速離心機實驗步驟一 材料與設備1)AE 緩沖液：50 mmol/L 乙酸鈉 (PH5.3)，lOmmol/LEDTA。2) 苯酚 (用 AE 緩沖液預先平衡）。3)10%SDS4)