Westernblot經驗談
哈哈,深蒙各位俠士對于兄弟的厚愛和信賴,恐怕我會令大家失望真正做western我也做的不多,不過由于效果都不是很差,所以就對于整個過程中的某些參數對于結果的影響沒有深究,正所謂真正經歷實驗失敗的人才會對具體細節理解深刻一樣,但是從關于western方面的文獻和資料來看,有關各個參數對于結果的影響是有高質量的paper闡述的,所以大俠們的這些問題和想法個人認為完全是可以做出一篇小論文評述的這兩天剛好有些時間,就把曾經看的資料都大致再看了一下,自己總結了一下,可能仍然對上述大俠們的問題沒有滿意的解釋,但可能會對大家的理解帶來些許的幫助,也希望大家能提出意見和建議,在你們這些大俠面前獻丑真是不好意思!首先有必要對整個蛋白電泳的背景有些了解:如今實驗室中用的最多的蛋白電泳是源于Lammli于1970年發表在nature上的一篇文章中的方法,這篇文章很特別,不僅被引用的次數較多,而且該篇并不是專門闡述蛋白電泳方法上的提出和改進問題,而是對......閱讀全文
Westernblot經驗談
哈哈,深蒙各位俠士對于兄弟的厚愛和信賴,恐怕我會令大家失望真正做western我也做的不多,不過由于效果都不是很差,所以就對于整個過程中的某些參數對于結果的影響沒有深究,正所謂真正經歷實驗失敗的人才會對具體細節理解深刻一樣,但是從關于western方面的文獻和資料來看,有關各個參數對于結果的影響是有
WesternBlot操作流程
試劑配制（一）母液1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g蒸餾水 200ml溶解后，用濃鹽酸調pH至所需點（見下所示），最后用蒸餾水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。 PH HCl7.4 約17ml7.5 約16m7.6 約15ml8.0 約10ml1.
westernblot實驗過程
Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。可按照以下步驟操作。1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)使用細胞裂解液，對貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品進行裂解。然后測定每個蛋白樣品
**瘙癢診療經驗談
**瘙癢是**不適中很常見的一種表現，對女性的生活和工作有一定影響。試想一下，女性朋友在非私密空間工作時如果出現了**瘙癢，這種想撓不能撓的狀態多么尷尬。 **瘙癢是什么原因引起的呢？**騷癢常見原因： 1、因為**屬肝，所以**癢主要責在于肝。引起**癢的主要原因為氣滯血瘀和氣血不足
westernblot操作注意事項
一．配膠 1． 注意一定要將玻璃板洗凈，最后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。 2． 分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲存液避光存放于4℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的
異源表達經驗談（3）
4. 菌種的保存、退化一般來說是加甘油20%左右，-70保存；或制成干粉保存。但是在做甲醇酵母時發現了個問題，就是重組工程菌的退化現象比較嚴重，一般都是學生做得好好的，但是畢業以后下面的師弟一接手，蛋白就不表達了，或表達量非常的低。連續好幾個師兄的結果都是如此，很是奇怪。我猜測可能是由于整合入基因組
異源表達經驗談（1）
異源蛋白的表達是個很復雜的問題，有許許多多的影響因素，而且由于蛋白本身千差萬別，很難有一個很完善或很標準的流程方法。另外，表達的宿主也是多種多樣，目前比較常用的包括E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆蟲細胞，哺乳動物細胞等，各自有著其本身的特點，優缺點各異。1. 宿主的選擇。表達宿主雖眾多，但比
異源表達經驗談（2）
2. 轉化子、表達子的篩選轉化子的篩選，由于許多質粒是穿梭質粒，因此大多具有E.coli中的抗性篩選標記，篩選起來是很方便的（當然，我不清楚細胞方面的篩選，一般使用病毒載體吧，希望高手們介紹一下）。但是轉化成功的并不意味著能夠成功表達目的蛋白了，因此還需要“表達子”的篩選，尤其是整合入基因組的片斷（
westernblot操作注意事項（二）
五．封閉及雜交1．封閉：將膜從電轉槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩一小時。必要時可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。2．結合一抗：一抗的準備：使用反貼法時每
蛋白質印跡(westernblot)
實驗原理印跡法一般由凝膠電泳；樣品的印跡和固定化；各種靈敏的檢測手段如抗體、抗原反應等三大實驗部分組成。生物大分子凝膠電泳分離 蛋白質印跡法的第一步一般是將蛋白質進行SDS聚丙烯酰胺平板凝膠電泳，使待測蛋白質在電泳中按相對分子質量大小在板狀膠上排列。2.分子區帶的轉移和固定 第二步就是反凝膠電泳已分
westernblot操作注意事項（一）
一．配膠1． 注意一定要將玻璃板洗凈，最后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。2． 分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲存液避光存放于4℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導致氣
液相色譜柱使用經驗談
色譜柱在使用前，最好進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測得的結果才有可比性。1、樣品的前處理：
液相色譜儀使用經驗談
色譜柱在使用前，進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是zui佳條件)，只有這樣，測得的結果才有可比性。 1、樣品的前處
如何確定RNA質量的經驗談
如何確定RNA質量的經驗談?1）檢測RNA溶液的吸光度?280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。1.82.0時，我們認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，不過要注
液相色譜柱使用經驗談
液相色譜柱使用經驗談色譜柱在使用前，最好進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測得的結果才有可比性
專家經驗談：活病毒成像指南
對于大多數生物學過程來說，所見即所得。由于病毒在感染性疾病中的作用，許多生物學家希望能夠實時觀察病毒的活動。要觀察病毒感染細胞和病毒裝配的過程，熒光成像是少數幾種非介入性的途徑之一。進行這樣的研究需要帶靈敏相機的高質量顯微鏡，能支持每秒多次成像。還需要確認熒光標簽和實驗設置不會干擾到我們想要研究
深靜脈血栓照護經驗談
靜脈血栓以紅血栓（或稱凝固性血栓）最常見。血栓形成后可向主干靜脈近端和遠端滋長和蔓延；其后在纖維溶解酶的作用下血栓可溶解消散，或血栓與靜脈壁粘連并逐漸纖維機化；最終形成邊緣毛糙、管徑粗細不一的再通靜脈。同時因靜脈瓣膜的破壞，造成繼發性深靜脈瓣膜功能不全。腫瘤外科因其疾病特殊性，患深靜脈血栓風險更高，
如何確定RNA質量的經驗談
1）檢測RNA溶液的吸光度 280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。1.82.0時，我們認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，不過要注意，當你用Tris
判斷肛瘺高低位技巧經驗談
? 雖然我們都學過**解剖，理論上都知道它由哪些肌肉組成。也知道高位肛瘺與低位肛瘺的界限，但是在臨床上，明確某個肛瘺主瘺管的位置高低，不是件容易的事。原因是**未切開前，瘺道到底穿越了哪些括約肌，很難準確判斷，便無法確定相應的治療方法。故多把治療高位肛瘺的掛線術錯用在了低位肛瘺上，給患者帶來不必
蛋白濃度多少做westernblot比較合適
Western-blot是一種半定量的檢測手段。 個人認為如果要通過灰度值來計算蛋白濃度，那就是和內參來做對比，因為內參的濃度是已知且單一條帶的蛋白樣品。通過待測樣品盒內參樣品灰度值做對比可以算出待測樣品大概的濃度。
westernblot中分離膠的濃度怎么選擇
western?blot中分離膠濃度的選擇取決于目的蛋白分子量 不同的分離膠濃度對不同的目的蛋白分子量的分辨率不一樣，比如15%的分離膠更適合45kDa的分目的蛋白，而10%的分離膠更適合70kDa的目的蛋白而因為western blot的膜應該是完全覆蓋SDS PAGE的凝膠，所以不用太擔心條帶在
westernblot中分離膠的濃度怎么選擇
western?blot中分離膠濃度的選擇取決于目的蛋白分子量 不同的分離膠濃度對不同的目的蛋白分子量的分辨率不一樣，比如15%的分離膠更適合45kDa的分目的蛋白，而10%的分離膠更適合70kDa的目的蛋白而因為western blot的膜應該是完全覆蓋SDS PAGE的凝膠，所以不用太擔心條帶在
westernblot膠不凝固是什么原因
1，復查一遍濃縮膠，分離膠各buffer的組分是否配制有誤，特別是pH，現在氣溫上升，原來冬天配制的溶液的pH和現在可能會相差很多，建議復查，如果pH不對，重新配過。一般情況下，對于pH有要求的溶液，季節更換的時候，基本要重新配過的。原來以貯存液形式存在的溶液，在稀釋用作工作液的時候，也要特別注意p
westernblot中分離膠的濃度怎么選擇
western blot中分離膠濃度的選擇取決于目的蛋白分子量 不同的分離膠濃度對不同的目的蛋白分子量的分辨率不一樣，比如15%的分離膠更適合45kDa的分目的蛋白，而10%的分離膠更適合70kDa的目的蛋白而因為western blot的膜應該是完全覆蓋SDS PAGE的凝膠，所以不用太擔心條帶在
westernblot膠不凝固是什么原因
1，復查一遍濃縮膠，分離膠各buffer的組分是否配制有誤，特別是pH，現在氣溫上升，原來冬天配制的溶液的pH和現在可能會相差很多，建議復查，如果pH不對，重新配過。一般情況下，對于pH有要求的溶液，季節更換的時候，基本要重新配過的。原來以貯存液形式存在的溶液，在稀釋用作工作液的時候，也要特別注意p
westernblot中分離膠的濃度怎么選擇
溴酚藍跑到膠的底部為準，26kD在10%的由下往上1/4的地方，而15%就在由下往上大約1/2（不太確定）的地方，對于分子量比較小的蛋白，膠的濃度越大，分離效果越好。但是必須考慮到，膠的孔徑一旦小于蛋白-SDS復合體的直徑，分子量大于這個蛋白的所有蛋白仍然不能有好的分離效果。如果孔徑太大，所有蛋白都
westernblot中分離膠的濃度怎么選擇
溴酚藍跑到膠的底部為準，26kD在10%的由下往上1/4的地方，而15%就在由下往上大約1/2（不太確定）的地方，對于分子量比較小的蛋白，膠的濃度越大，分離效果越好。但是必須考慮到，膠的孔徑一旦小于蛋白-SDS復合體的直徑，分子量大于這個蛋白的所有蛋白仍然不能有好的分離效果。如果孔徑太大，所有蛋白都
westernblot中分離膠的濃度怎么選擇
western blot中分離膠濃度的選擇取決于目的蛋白分子量 不同的分離膠濃度對不同的目的蛋白分子量的分辨率不一樣，比如15%的分離膠更適合45kDa的分目的蛋白，而10%的分離膠更適合70kDa的目的蛋白而因為western blot的膜應該是完全覆蓋SDS PAGE的凝膠，所以不用太擔心條帶在
westernblot中分離膠的濃度怎么選擇
western blot中分離膠濃度的選擇取決于目的蛋白分子量 不同的分離膠濃度對不同的目的蛋白分子量的分辨率不一樣，比如15%的分離膠更適合45kDa的分目的蛋白，而10%的分離膠更適合70kDa的目的蛋白而因為western blot的膜應該是完全覆蓋SDS PAGE的凝膠，所以不用太擔心條帶在
做血常規半年之個人經驗談（二）
事情太多了，再說就有點賣弄的味道了，還是談談自己對檢驗的看法。1，檢驗最重要的是要靈活。檢驗的基礎是準，做不準，我們就沒有與臨床對話的資本，做得不準，談什么都沒有意義了，但是大家不要始終在一個準字上下工夫，檢驗的核心應該是活，靈活。這個社會什么都要活，用時髦點的語言來講，就是不要照抄照搬，不要教條主