重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊
edited by Bruce A. Roe Judy S. Crabtreeand Akbar S. KhanDepartment of Chemistry and Biochemistry The University of Oklahoma &nb......閱讀全文
重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊
?edited by??????????????? Bruce A. Roe??????????????? Judy S. Crabtreeand Akbar S. KhanDepartment of Chemistry and Biochemistry??????????????? The Uni
重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊3
G. Bacterial cell maintenanceFour strains of?E. coli?are used in these studies: JM101 for M13 infection and isolation (4), XL1BMRF' (Stratagene) f
重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊4
H. Fragment purification on Sephacryl S-500 spin columnsDNA fragments larger than a few hundred base pairs can be separated from smaller fragments by
重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊6
Electroporation ProtocolPreparation of Electro-competent Cells:1. Grow XL1-Blue cells on a tetracycline plate (20 ug tet/ml of LB agar)2. Inoculate 3
重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊2
C. Restriction digestionRestriction enzyme digestions are performed by incubating double-stranded DNA molecules with an appropriate amount of restrict
重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊8
B. Midiprep double-stranded DNA isolationA midi-prep double-stranded DNA isolation has been developed to generate a sufficient amount of template DNA
重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊5
C. Random fragment end-repair, size selection, and phosphorylationSince both sonicated and nebulized DNA fragments usually contain single-stranded end
重組DNA的分離、克隆與測序實驗手冊7
III. Methods for DNA isolationA. Large scale double-stranded DNA isolationThe method used for the isolation of large scale cosmid and plasmid DNA is a
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定1
重組DNA是在體外用限制性內切酶，將不同來源的DNA分子進行特異地切割，獲得的目的基因或DNA片段與載體重新連接，從而組成一個新的DNA雜合分子。重組的DNA分子能夠通過一定的方式進入相應的宿主細胞，在宿主細胞中進行無性增殖，獲得大量的目的基因或DNA片段，此過程稱基因克隆。重組的DNA分子也能夠在
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定2
（1）CaCl2處理以后的轉化: 當細菌處于0℃、二價陽離子（如Ca2+、Mg2+等）低滲溶液中時，細菌細胞膨脹成球形，處于感受態；此時轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，重組DNA在42℃短時間熱沖擊后吸附在細胞表面，在豐富培養基中生長數小時后，球狀細胞恢復原
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定3
當多克隆位點有外源DNA片段插入時，破壞此酶的N端閱讀框架，產生無α互補功能的N端片段，因此在帶有外源DNA片段的細菌在含有IPTG/X-gal的培養基上呈白色，見圖7-11 。如果外源DNA插入片段相當短，不破壞β-半乳糖苷酶的氨基端氨基酸序列的閱讀框，有時產生的重組體菌落不呈白色而是呈淺藍色。4
測序污染有多危險，如何防范與去除[實驗手冊]
一些研究表明，目前已經公布的基因組存在多種污染，隨著這個問題越來越突出，我們需要找出方法來應對 生物通報道：Supratim Mukherjee在進行數據分析的時候，發現數以百計的微生物基因組中會重復出現同一種噬菌體序列，這令他感到很驚訝。這位來自勞倫斯伯克利國家實驗室的生物信息學家最開始是為
差異表達－cDNA－的重新擴增、克隆與測序實驗
試劑、試劑盒?瓊脂糖凝膠蒸餾水 DNA 點樣染料甘油蒸餾水 溴酚藍 二甲苯腈 FF溴化乙錠溶液任意引物（H-AP)cDNAdNTP 混合液未標記的錨定引物載體特異性引物PCR 緩沖液Tris-HClKClMgCl2明膠 TaqDNA 聚合酶儀器、耗材?電泳裝置離心管熱循環儀薄壁 PCR 管UV 透射
差異表達－cDNA－的重新擴增、克隆與測序實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 瓊脂糖凝膠 蒸餾水 DNA 點樣染料 甘油 蒸餾水 溴酚藍 ? 二甲苯腈 FF 溴化乙錠
差異表達－cDNA－的重新擴增、克隆與測序實驗
從丙烯酰胺凝膠上切下潛在的差異表達 cDNA 之后，用同一種錨定-任意引物組合重新擴增 cDNA, 反應條件與最初 PCR 相同。重新擴增的產物，可以進行克隆和測序，以供進一步分析。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。試劑、試劑盒瓊脂糖凝膠蒸餾水DNA 點樣染料甘油蒸餾水溴
DNA重組實驗方法
[實驗原理]DNA重組是將外源DNA與載體分子連接，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法。 重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。常用的DNA連接酶是T4噬
菌落－PCR－分析克隆的重組體實驗
菌落 PCR 分析克隆的重組體實驗試劑、試劑盒溴化乙錠Taq 延伸 PCR 添加劑Tween2010% 溶液dNTP 溶液PCR 緩沖液熱穩定 DNA 聚合酶引物儀器、耗材無菌槍頭瓊脂糖凝膠電泳設備和試劑實驗步驟一、材料1. 緩沖液、溶液和試劑溴化乙錠Taq 延伸 PCR 添加劑（Stratagen
菌落－PCR－分析克隆的重組體實驗
試劑、試劑盒 溴化乙錠Taq 延伸 PCR 添加劑Tween2010% 溶液dNTP 溶液PCR 緩沖液 熱穩定 DNA 聚合酶引物儀器、耗材 無菌槍頭瓊脂糖凝膠電泳設備和試劑實驗步驟 一、材料1. 緩沖液、溶液和試劑溴化乙錠Taq 延伸 PCR 添加劑（Stratagene)Tween20，10%
菌落－PCR－分析克隆的重組體實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因組DNA，不必酶切鑒定，而是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進行PCR擴增，省時少力。使用載體上的通用引物，進行重組體的篩選或者DNA測序分析。最后的PCR產物大小是載體通用
DNA片段的亞克隆實驗
實驗材料 DNA試劑、試劑盒 CIPdNTPDNA聚合酶T4聚合酶DTTATP儀器、耗材 水浴鍋電泳儀培養箱實驗步驟 1. ?在20 μl 反應體積內用合適的酶完全消化DNA。75℃加熱15 min，滅活酶。如若無需進一步的酶促處理，接歩驟6。2. ?如果5’磷酸需要去除，加入2 μl 10×CIP
DNA片段的亞克隆實驗
基本方案 凝膠塊中DNA連接 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 DNA 試劑、試劑盒
重組克隆的概念
中文名稱重組克隆英文名稱recombinant clone定 義含有重組核酸分子或其片段的分子克隆或細胞克隆。應用學科生物化學與分子生物學（一級學科），方法與技術（二級學科）
分子克隆實驗DNA片段與載體連接方法介紹
DNA分子與載體分子連接是克隆過程中的重要環節之一，方法有：①粘性末端連接，DNA片段兩端的互補堿基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內切酶消化DNA可產生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復原樣，有些限制性內切酶雖然識別不同順序，卻能產生相同末端。②平頭末端連接，用物理方法制備的DNA往往是平頭
生物安全與重組DNA技術
重組DNA技術涉及到組合不同來源的遺傳信息，從而創造自然界以前可能從未存在過的遺傳修飾生物體（genetically modified organisms，GMOs）。最初，在分子生物學家中有人擔心這些生物體可能具有不可預測的不良性狀，一旦從實驗室逸出將帶來生物學危害。這種擔心在 197
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體3
在作為載體時，這些噬菌體有一個很大的優點，即克隆到M13mp載體的外源DNA片段（雙鏈），在子代噬菌體便成為了單鏈形式。故應用M13mp進行克隆，可方便地分離到大量含有外源DNA某一單鏈的DNA分子。這種單鏈DNA可在下列工作中作模板：①主要用作雙脫氧鏈終止法進行DNA序列測定的模板；②制備僅有一條
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體2
二、噬菌體載體作為細菌寄生物的噬菌體，大多數具有編碼多種蛋白質的基因，能利用宿主細胞的蛋白質合成體系，進行生長和增殖。構建的噬菌體載體，以λ噬菌體、M13和粘粒最為常用。㈠ λ噬菌體載體野生型λDNA是一種基因組為4.8 kb的線性雙鏈DNA，全部序列已知，共編碼50多個基因。其中約一半基因參與
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體1
載體（vector）是攜帶靶DNA（目的DNA）片段進入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具。常用的載體是通過改造天然的細菌質粒、噬菌體和病毒等構建而成。目前已構建成的載體主要有質粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體等多種類型，亦可根據其用途不同分為克隆載體和表達載體二類。載體的構建和選擇應考慮以下
克隆化酵母DNA的操作實驗
實驗材料?酵母實驗步驟 ? 將待研究的基因亞克隆到YIP質粒。2.? 用限制性內切酶在克隆化基因內部切開，使質粒線性化。3.? 用1~10 μg DNA加上擔體DNA轉化適合的菌株，通過質粒上帶的標記進行選擇，在選擇培養基上純化幾個轉化子，制備DNA，應用Southern 雜交確證整合是否發生在所期
分子克隆實驗載體DNA的選擇
①質粒：質粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA呈環狀，大小為1-200千堿基對(kb)。在細胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態，一是“緊密型”；二是“松弛型”。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質粒型載體一般只能攜帶10kb以下的
DNA重組實驗中常用的技術(一）
一、質粒DNA的提取及鑒定（一）質粒DNA的提取及鑒定 1．收獲細菌 （1）將2ml含相應抗生素的LB液體培養基加入到通氣良好的15ml的試管中，接入一單菌落，于37℃劇烈振蕩培養過夜。 （2）將1.5ml培養物倒入1.5ml離心管中，用臺式離心機于4℃以12000g離心5min，將剩余的培養